Probióticos são enviados ao espaço
Avaliação da viabilidade de LcS liofilizado e encapsulado na Estação Espacial Internacional
Mais de 50 anos se passaram desde que a humanidade começou a explorar o espaço sideral. Graças aos esforços contínuos dos astronautas, bem como dos cientistas espaciais, várias descobertas sobre a fisiologia do corpo humano no espaço foram relatadas. O estabelecimento da Estação Espacial Internacional (ISS) acelerou as investigações sobre as respostas fisiológicas a estadas prolongadas no espaço. Evidências acumuladas sugerem que a exposição em longo prazo ao ambiente espacial pode afetar negativamente a função imunológica humana. O enfraquecimento do sistema imunológico aumenta o risco de doenças infecciosas ou mesmo de câncer. Com objetivo futuro de explorar a fundo a Lua ou Marte, é essencial que sejam estabelecidas medidas para combater a supressão do sistema imunológico.
Os probióticos são definidos pela Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura (FAO-OMS) como ‘microrganismos vivos que conferem benefícios à saúde do hospedeiro quando administrados em quantidades adequadas’. A administração de determinados probióticos modula a função imunológica e ajuda a fornecer um bom equilíbrio da microbiota intestinal, aumentando a abundância de bactérias benéficas, como bifidobactérias e lactobacilos, e diminuindo a abundância de bactérias nocivas. Acumulam-se evidências de que um desses probióticos eficientes, o Lactobacillus casei Shirota (L. casei YIT 9029; LcS) pode elevar a imunidade inata e, em particular, aumentar a atividade das células Natural Killer (NK), provavelmente por meio da indução da produção de interleucina (IL)-12 por monócitos/macrófagos.
O LcS chega vivo ao intestino e equilibra a microbiota intestinal, e tem um longo histórico de uso seguro em alimentos (mais de 80 anos), tendo sido certificado pela Food and Drug Administration (FDA), órgão que regulamenta alimentos e medicamentos nos Estados Unidos – como ‘Geralmente Reconhecido como Seguro’ (Generally Recognized as Safe – GRAS). Considerando sua eficácia e segurança, o LcS tem potencial para uso no combate a possíveis problemas imunológicos em tripulantes que permanecem no espaço por longos períodos de tempo. Para avaliar sua eficácia, foi iniciado um projeto de pesquisa espacial humana em cooperação com os astronautas que permanecem na ISS.
Manter refrigerados produtos que contêm microrganismos é uma maneira eficiente de prolongar sua vida útil, mas um dos desafios do uso de probióticos na ISS é o uso limitado de refrigeração. Além disso, em termos de requisitos operacionais na estação, é essencial evitar a difusão de materiais probióticos no ambiente de microgravidade para evitar danos aos dispositivos mecânicos. Para lidar com esses desafios, foi desenvolvida uma cápsula contendo LcS liofilizado (cápsula LcS) que é capaz de mantê-lo vivo por longos períodos em temperatura ambiente. Para os experimentos espaciais, também foi criada uma embalagem contendo as cápsulas LcS (‘Probiotic Package’) específica para atender aos requisitos operacionais da ISS. O ‘Probiotic Package’ foi lançado ao espaço e armazenado na ISS por um mês. A embalagem foi recuperada da ISS e, em seguida, foram avaliados os efeitos das condições ambientais (temperatura e doses de radiação espacial) e as propriedades básicas do LcS em comparação com os controles que estavam armazenados na Terra durante o mesmo período.
Estrutura da embalagem
Para evitar a difusão das cápsulas danificadas durante o transporte, inclusive durante seu lançamento na nave de reabastecimento para a ISS, as cápsulas LcS foram embaladas duas vezes em um press-through-package (PTP) como embalagem primária e um envelope laminado de alumínio como embalagem secundária. Dessecantes foram incluídos no interior do envelope laminado de alumínio para evitar a absorção de umidade pelo LcS liofilizado. Uma embalagem do probiótico continha quatro peças de folhas de PTP, com 40 cápsulas (10 cápsulas/folha) no total.
Um registrador de dados de temperatura e um dosímetro passivo para experimentos da ciência da vida para espécimes biológicos no espaço (Bio PADLES; JAXA, Tsukuba, Japão) foram colocados nas embalagens para monitorar a temperatura ambiental e as doses de radiação espacial. A estabilidade dos materiais e a estrutura do ‘Probiotic Package’ foram revisadas pelo Serviço de Garantia de Missão e Segurança Humana no Espaço da Agência de Exploração Aeroespacial do Japão (JAXA) e pelo Departamento de Garantia de Segurança e Produto da Japan Manned Space Systems Corporation (Tóquio, Japão), com as embalagens sendo previamente aprovadas para lançamento à ISS.
Condições ambientais durante o período de estudo
A 8ª missão comercial de reabastecimento (Spx-8) da espaçonave SpaceX/Dragon foi usada para o lançamento das amostras (FS) do ‘Probiotic Package’ à ISS e pelo retorno à Terra. Após um mês de armazenamento na ISS, o FS foi devolvido à Terra com sucesso e sem danos à embalagem externa, às cápsulas, ao registrador de dados de temperatura ou Bio PADLES. Foram avaliadas as variações de temperatura do FS e os controles em solo nos Estados Unidos (GC-US) e no Japão (GC-JP). O FS foi mantido em temperatura ambiente em uma faixa entre 19oC e 24,5oC desde o armazenamento no armazém em Houston até o retorno à Terra proveniente da ISS, com temperatura média de 21,5oC. Durante o armazenamento na ISS (entre 10 de abril de 2016 e 12 de maio de 2016, hora padrão japonês; JST), a temperatura variou entre 20oC e 24,5oC. GC-US e GC-JP foram mantidos estáveis em cerca de 20oC a 22oC durante o período correspondente.
Os produtos do estudo foram mantidos de 4oC a 10oC durante outros períodos (leia mais em materiais e métodos), exceto durante a exposição temporária à temperatura ambiente – quando foram removidos dos refrigeradores. Em relação aos resultados dosimétricos para o FS durante um mês de armazenamento na ISS, a dose total absorvida foi de 8,53 ± 0,67 mGy em água, e a dose equivalente total foi de 17,08 ± 1,39 mSv. A taxa de dose absorvida do FS foi de 0,26 ± 0,02 mGy/dia e a taxa de dose equivalente de 0,52 ± 0,04 mSv/dia. Esses valores foram aproximadamente 130 vezes maiores do que os observados no GC-JP (0,002 mGy/dia e 0,004 mSv/dia, respectivamente).
Sobrevivência do LcS durante o armazenamento
Foram avaliadas alterações longitudinais na quantidade de LcS viáveis (unidades formadoras de colônias – UFC). A quantidade média de LcS viável foi de 2,12 × 1011 UFC/g pó na linha basal (medido logo após embalar o produto do estudo), e diminuiu gradualmente durante o período do estudo, como também foi observado nos controles em solo. Cerca de seis meses após o início do experimento, a quantidade de LcS no FS atingiu 1,05 × 1011 UFC/g pó (49,5% do valor inicial). Os valores em GC-US e GC-JP foram de 8,05 × 1010 UFC/g pó (38,0%) e 9,03 × 1010 UFC/g pó (42,6%), respectivamente. Ao final do período de estudo, a viabilidade do LcS também foi avaliada através da permeabilidade da membrana celular à monoazida de propídio, usando PCR quantitativo (PMA-qPCR) e primers específicos do LcS. O resultado para o FS (12,5 ± 0,02 log10 células/g pó, média ± desvio padrão) foi equivalente aos de GC-US (12,4 ± 0,08 log10 células/g pó) e GC-JP (12,4 ± 0,10 log10 células/g pó).
Modificações genéricas, fermentação de carboidrato e perfil de crescimento
Foram examinados os padrões da banda dos fragmentos de DNA amplificados aleatoriamente usando seis primers diferentes. A análise de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) revelou nenhuma modificação genética no FS em comparação com a linha basal (DNA extraído logo após embalar o produto do estudo), GC-US ou GC-JP. Também foi realizado o resequenciamento completo do genoma das amostras FS, GC-US, GC-JP e da linha basal. As variâncias de sequência de referência do LcS (não publicada) no cromossomo, bem como no plasmídeo pLY101, foram avaliadas. Os perfis da frequência das variâncias de sequência foram semelhantes entre os produtos do estudo, e nenhuma variante significativa de nucleotídeo único foi detectada. As propriedades de fermentação de carboidratos não foram alteradas pelo voo espacial. A curva de crescimento e o perfil de mudança do pH do LcS no FS também foram semelhantes aos dos controles em solo.
Propriedades imunomoduladoras
Os polissacarídeos da parede celular do LcS e a estrutura da parede celular, que é resistente à digestão por fagócitos, desempenham papéis importantes na modulação do sistema imunológico do hospedeiro pelo LcS. Portanto, a integridade dos polissacarídeos da parede celular foi avaliada analisando a reatividade ao anticorpo monoclonal L8, que é específico para os polissacarídeos do LcS, e a resistência à digestão intracelular foi examinada in vitro usando N-acetilmuramidase. Os microrganismos no FS reagiram com o anticorpo L8 da mesma maneira que aqueles em GC-US e GC-JP. O LcS em todos os produtos do estudo foi resistente à enzima digestiva da parede celular. Usando macrófagos derivados de rato J774.1, foi avaliada a capacidade de indução de IL-12 de LcS no FS, GC-US e GC-JP. Todas as amostras induziram IL-12 de forma dose-dependente em níveis equivalentes.
Materiais e métodos
O pó liofilizado do LcS, as cápsulas e o ‘Probiotic Package’ foram produzidos pelo Instituto Central Yakult (YCI, Tóquio, Japão). As cápsulas com LcS foram embaladas nas folhas de PTP pela API Co., Ltd (Gifu, Japão) – 10 cápsulas por folha. Quatro cartelas (folhas) foram, então, inseridas no envelope de alumínio laminado contendo dessecadores. O FS, uma das amostras para GC-JP e outra para GC-US continham o Bio PADLES (JAXA), bem como um registrador de dados de temperatura. O Bio PADLES foi usado para medir doses de radiação espacial para lactobacilos na ISS ou na Terra, inclusive durante o transporte aéreo entre o Japão e os Estados Unidos.
Dosimetria de radiação espacial
Cada Bio PADLES continha quatro placas detectoras de rastros nucleares de plástico CR-39 e sete elementos de dosímetros termoluminescentes. O método de dosimetria usado pelo Bio PADLES está descrito em artigos anteriores.
Teste de fermentação do carboidrato
Uma porção de espátula de pó de LcS foi incubada em meio MRS a 37°C durante a noite. Uma porção da cultura foi incubada em novo meio MRS a 37°C durante a noite novamente. Após centrifugação da suspensão a 1.660 g a 4°C por 20 min, o sedimento resultante foi suspenso em meio API 50 CHL (SYSMEX bioMérieux Co., Ltd, Tóquio, Japão). Uma tira API 50 CH foi usada de acordo com instruções do fabricante para avaliar a capacidade da suspensão de fermentar carboidratos.
Cronograma de manuseio do produto de estudo
Todas as datas estão em JST. Os produtos do estudo foram embalados no dia 2 de dezembro de 2015 e mantidos em condições frias (refrigeração e caixas térmicas durante o transporte). O FS e o GC-US foram transportados para os Estados Unidos por via aérea, enquanto o GC-JP ficou em um refrigerador no YCI. Em 14 de dezembro 2015, o FS foi transferido para um armazém à temperatura ambiente. No mesmo período, GC-US e GC-JP foram transferidos para incubadoras (temperatura ajustada a 22oC) no Centro Espacial Johnson da National Aeronautics and Space Administration (NASA) – JSC; Houston, TX, EUA – e no YCI, respectivamente. Após o transporte para o Centro Espacial Kennedy da NASA (FL, EUA), o FS foi armazenado na SpX-8. Em 9 de abril de 2016, a SpX-8 foi lançada e acoplada com sucesso na ISS, no dia seguinte.
O FS foi, então, armazenado no módulo experimental japonês ‘Kibo’. O FS foi trazido de volta pela espaçonave Dragon cerca de um mês depois e retornou à Terra em 12 de maio de 2016. Depois de cair no Oceano Pacífico, o FS foi recuperado da cápsula Dragon e mantido refrigerado durante o transporte para o JSC. Ao chegar ao JSC, o FS foi transferido para um refrigerador. GC-US e GC-JP foram transferidos para refrigeradores no dia que a Dragon caiu no mar. O FS e o GC-US foram trazidos de volta ao Japão por via aérea em caixas térmicas, e entregues ao YCI em 27 de maio de 2016 para avaliação. Os data loggers de temperatura e os Bio PADLES foram enviados posteriormente para a JAXA para análises de dosimetria de temperatura e radiação espacial.
Contagem do LcS através de meio de cultura e PMA-pPCR
Para cultura, 0,1g de pó de LcS liofilizado da cápsula de LcS de cada produto do estudo foi suspenso em 9,9ml de solução salina e, depois, submetido a diluições em série de 10 vezes. As suspensões foram incubadas aerobiamente em ágar PCA com BCP (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd, Tóquio, Japão, para medições em YCI; HIMEDIA Laboratories Pvt, Ltd, Mumbai, Índia, para medições em JSC) a 37°C por até 72h. As placas incubadas contendo de 30 a 300 colônias foram usadas para contagem. Para PMA-qPCR, 0,1g de pó de LcS foi suspenso em 9,9ml de PBS. Em seguida, 200 μL da suspensão foram adicionados a 800 μL de PBS. Após centrifugação da suspensão a 20.00 g a 4°C por 5 min, o sedimento resultante foi lavado duas vezes, suspenso em 2 μL de PMA 5mM (Biotium Inc., Fremont, CA, EUA), mantido em gelo por 5 min e, em seguida, submetido à fotoativação por LED Crosslinker (Takara Bio Inc., Shiga, Japão) por 10 min. A amostra tratada com PMA foi preservada a -80°C até a extração do DNA. A extração do DNA e o PCR quantitativo foram conduzidos conforme relatórios anteriores, usando primers específicos para LcS, ou seja, pLcS-57F, CTCAAAGCCGTG ACGGTC e pLcS-597R, ACGTGGTGCTAATAATCCTAGTG (5’–3′).
Análise RAPD
Uma porção de espátula do pó liofilizado de LcS foi incubada em meio MRS a 37°C durante a noite. Após centrifugação (20.400 g, 4°C por 3 min), o sedimento foi ressuspenso com tampão de extração de DNA. Grânulos de vidro e cloreto de benzila foram adicionados à suspensão, e a mistura foi agitada vigorosamente usando FastPrep (MP Biomedicals LLC, Santa Ana, CA, EUA). Após a denaturação das proteínas por adição de dodecil sulfato de sódio, o acetato de sódio foi adicionado para extração de DNA e a mistura foi centrifugada (20.400 g, 4°C por 8 min). O sobrenadante resultante foi submetido à precipitação com isopropanol. O DNA coletado por centrifugação foi suspenso em tampão TE. O programa de amplificação foi o seguinte: um ciclo a 94°C por 2 min; cinco ciclos a 94°C por 30 s, 36°C por 60 s e 72°C por 90 s; 29 ciclos a 94°C por 20 s, 36°C por 30 s e 72°C por 90 s; e um ciclo a 72°C por 3 min. As sequências dos primers (5’–3′) foram as seguintes: p1254, CCGCAGCCAA44; p1281, AACGCGCAAC44; p1252, GCGGAAATAG44; p1280, GAGGACAAAG44; pRPIR, GGCGTCGGTT45; epRPICGR, GGCCACGGAA45. Os fragmentos de DNA amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%.
Ressequenciamento de genoma completo e análises de variância de sequência
O pó de LcS foi suspenso em meio MRS para fazer suspensão a 0,1% (p/v) e incubado a 37°C até 300 unidades Klett. Após centrifugar duas vezes (10.000 g, 4°C por 30 min e 20.000 g, 4°C por 5 min, respectivamente), o sedimento foi ressuspenso com tampão TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8,0). O DNA genômico foi preparado usando ZR Fungal/Bacterial DNA Mini PrepTM (Zymo Research Corp., Irvine, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 2,1 μg do DNA genômico foram fragmentados para o tamanho de cerca de 800 pb pelo sistema de cisalhamento de DNA M220 (Covaris, Inc., Woburn, MA, EUA). As bibliotecas de sequências foram preparadas usando o kit TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep LS (Illumina, Inc., San Diego, CA, EUA). Após o tratamento de denaturação, 15 pM das bibliotecas foram submetidas ao sequenciamento final pareado (250 pb × 2) com MiSeq (Illumina, Inc.).
Os dados lidos foram importados para o CLC Genomics Workbench (CLC Bio, Finlandsgade, Dinamarca) e o corte de sequência foi realizado pelas seguintes configurações: corte usando limite de pontuação de qualidade = 0,05; cortar nucleotídeos ambíguos = 2; e descarte as leituras abaixo de comprimento = 150. As leituras de sequência limpas foram mapeadas para o conjunto do genoma LcS de referência (atualmente não disponível no repositório público devido à propriedade intelectual da Yakult Honsha Co., Ltd. O resumo da análise do genoma é descrito no documento de nota do GRAS). A frequência da variância de sequência foi avaliada na posição em que as seguintes condições foram satisfeitas: profundidade para o cromossomo > cobertura de sequência × 1/3; profundidade para o plasmídeo >3× cobertura da sequência; e SP (valor P de polarização da fita com escala Phred) <13. A frequência da variância superior a 50% é considerada uma variante significativa de nucleotídeo único.
Avaliação da reatividade ao anticorpo específico do LcS
O pó de LcS foi suspenso em PBS a 2 mg/ml e mantido por 30 min em temperatura ambiente. O sobrenadante foi recolhido como suspensão de LcS. Quatrocentos microlitros da suspensão de LcS foram misturados com 600 μL de PBS. Após centrifugação a 10.000 g a 4°C por 5 min, o sedimento foi submetido à avaliação de reatividade contra o anticorpo monoclonal específico do LcS L827, usando 100 μL de uma diluição de 10 vezes de seu sobrenadante da cultura de hibridoma. Após a incubação a 4°C durante a noite, as células foram lavadas duas vezes com PBS e, depois, incubadas com 100 μL de um anticorpo de cadeia leve de imunoglobulina de camundongo com FITC (clone RMK-45, BioLegend, San Diego, CA, EUA; diluição de 200 vezes) em temperatura ambiente por 20 min. Após serem lavadas com PBS, as células foram ressuspensas em PBS e analisadas usando um citômetro de fluxo Gallios (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, EUA).
Teste para resistência à enzima digestiva da parede celular
A enzima digestiva de parede celular M-1 (N-acetilmuramidase SG, Seikagaku Co. Ltd, Tóquio, Japão) foi adicionada à mesma suspensão de LcS que foi preparada para a análise da reatividade do anticorpo. A concentração final foi de 50 μg/ml e a suspensão foi incubada a 37°C por até 120 min. Nos tempos 0, 30, 60 e 120 min, 200 μL da solução de reação foi coletado e aquecido a 100°C por 5 min para encerrar a reação enzimática. Em seguida, foram adicionados 50 μL de solução de dodecil sulfato de sódio a 10% e misturados bem. A densidade óptica da solução foi medida em um comprimento de onda de 600 nm, e um valor relativo (%) foi calculado por comparação com o valor inicial.
Análise de produção de citocinas
A mesma suspensão de LcS que foi preparada para a análise da reatividade do anticorpo foi adicionada nas concentrações finais de 20, 60 ou 200 μg/ml a 10% de meio FCS/RPMI 1640 contendo 50 U/ml de penicilina e 50 μg/ml de estreptomicina. A mistura foi, então, incubada com a linhagem celular J774.1 (1 × 105 células/200 μL em cada poço) em uma placa de cultura de 96 poços por 24h a 37°C. O sobrenadante foi, então, submetido a ensaio imunoenzimático para medir IL-12p40, conforme relatado anteriormente.
Análise do padrão de crescimento
Todo o pó de LcS em uma cápsula foi suspenso em 10ml de meio MRS. A suspensão foi, ainda, diluída 20 vezes em meio MRS e a suspensão diluída foi incubada em novo meio MRS a 1% (v/v) a 37°C por até 24h. Amostras de cultura foram coletadas a cada quatro horas, e a contagem de LcS foi enumerada como unidades formadoras de colônias após cultura em meio de ágar MRS (37°C, 48h a 72h). Também medimos o pH das amostras cultivadas com um medidor de pH.
Discussão avalia viabilidade da cepa
Até onde se sabe, nenhum artigo científico foi publicado antes sobre a estabilidade de produtos com probióticos na ISS. Este estudo abriu, assim, a primeira porta para a utilização de microrganismos benéficos vivos como ingredientes alimentares funcionais no espaço sideral. Fatores ambientais, como temperatura e umidade, afetam a estabilidade dos microrganismos vivos. Além disso, existem vários fatores exclusivos dentro da ISS, como confinamento, microgravidade e radiação espacial, e é muito importante monitorar esses parâmetros o máximo possível. Neste estudo, os dados reais de dosimetria de radiação espacial foram coletados como variáveis específicas mensuráveis do espaço. Além disso, as temperaturas durante o armazenamento do produto do estudo foram monitoradas. Não foram coletados dados de umidade, pois os produtos continham dessecantes.
A dose diária de irradiação para o FS foi de 0,26 mGy/dia, ou 0,52 mSv/dia. Esses valores são da mesma ordem dos informados anteriormente. A temperatura ambiente nos módulos da ISS é controlada entre 21oC e 23oC, em média. Os dados de temperatura reais obtidos neste estudo variaram entre 20oC e 24,5oC. Considerando essas informações coletivamente, as condições ambientais ao redor do FS podem ser consideradas típicas daquelas dentro da ISS e podem ser extrapoladas para operações em estudos humanos com os astronautas. As condições de temperatura do GC-US e do GC-JP, em cerca de 20oC, também foram cientificamente sólidas como controles em solo para comparação com os dados do FS.
Para que os probióticos sejam eficazes, é essencial manter um número suficiente de microrganismos vivos até a administração. Durante o período do estudo, inclusive durante o armazenamento em temperatura ambiente por aproximadamente cinco meses na Terra e na ISS, a contagem de LcS viável no FS foi mantida em 1011 UFC/g de pó. Um grama de pó de LcS representa a dose diária para estudos em humanos (equivalente a cinco cápsulas/dia). Uma dose diária de 4 × 1010 UFC ou mais de LcS é preferível para aumentar a função imune. Os resultados deste estudo sugerem que o ‘Probiotic Package’ é capaz de manter o LcS vivo em quantidade suficiente, mesmo na ISS.
Propriedades
A viabilidade é um bom indicador das propriedades básicas dos probióticos, mas a viabilidade por si só pode não ser suficiente para elucidar a estabilidade do LcS durante o voo espacial. Portanto, foram realizadas análises genéticas e avaliações funcionais do LcS no FS in vitro e os resultados foram comparados com os dos controles em solo. Análises RAPD e testes de fermentação de carboidratos são usados frequentemente para identificar espécies ou cepas bacterianas de perspectivas genéticas e metabólicas. Essas avaliações revelaram que não houve diferença no FS em comparação com GC-US e GC-JP. Além disso, as análises de frequência da variância de sequência não detectaram nenhuma modificação genética no FS em comparação com os controles em solo.
O padrão de crescimento, indicando a atividade dos microrganismos vivos, não diferiu entre os produtos estudados. A reatividade a um anticorpo monoclonal específico de LcS, a resistência a uma enzima digestiva da parede celular e a capacidade de indução de IL-12 foram utilizadas para avaliar as propriedades de modulação imunológica potenciais. O LcS no FS, assim como em GC-US e GC-JP, reagiu com o anticorpo monoclonal, foi resistente à enzima digestiva da parede celular e induziu a produção de IL-12. Esses resultados estão em conformidade com as características fundamentais do LcS. Considerando todos esses resultados, concluímos que as características genéticas e funcionais do LcS presentes no ‘Probiotic Package’ não foram alteradas durante o armazenamento na ISS por um mês.
Limitações para a interpretação dos resultados
Investigações microbiológicas no espaço sideral, principalmente usando patógenos, sugerem que os voos espaciais podem alterar o comportamento dos microrganismos, por exemplo, aumentar a virulência da Salmonella typhimurium, promover a formação de biofilme pela Pseudomonas aeruginosa e reduzir a viabilidade do Staphylococcus epidermidis. Experimentos microbiológicos recentes com modelos de microgravidade simulados produziram diferenças controversas nos resultados obtidos nas condições aeróbicas e anaeróbicas em termos de estabilidade do Lactobacillus acidophilus. Todos esses experimentos foram conduzidos com meios de cultura nos quais os microrganismos estavam em estado ativo. Por outro lado, o ‘Probiotic Package’ foi desenvolvido para minimizar o teor de umidade e a atividade do LcS até seu consumo pelos membros da tripulação. A configuração empregada no ‘Probiotic Package’ é mais adequada do que a forma líquida para evitar os efeitos incontroláveis do ambiente da ISS. Os pesquisadores reconhecem que existem várias limitações para a interpretação dos resultados do estudo. A questão mais importante é a curta duração (um mês) de armazenamento na ISS, porque a maioria dos astronautas permanece na estação por mais tempo: cerca de meio ano.
O número de naves de reabastecimento também é limitado no momento, portanto, a duração prática de armazenamento do produto do estudo é atualmente considerada de alguns meses. Devido aos recursos limitados, não foi possível armazenar o ‘Probiotic Package’ por mais tempo desta vez. Neste estudo, foi adotada uma abordagem ‘macro’ usando uma série de ensaios bioquímicos, uma análise RAPD e uma análise de frequência da variância de sequência, com o objetivo principal de avaliar as propriedades diretas do probiótico como ingrediente alimentar – não foi abordado o efeito do ambiente do espaço sideral na taxa de mutação. No entanto, este último seria uma preocupação para a comunidade científica, como já foi argumentado em outros experimentos microbiológicos no espaço. Isso será testado como parte deste estudo futuramente. Concluindo, o armazenamento de um mês do ‘Probiotic Package’ na ISS não afetou as propriedades básicas do LcS como probiótico. A qualidade do probiótico é bem mantida pela estrutura do produto. O artigo ‘Probióticos no espaço sideral: avaliação da viabilidade de probióticos liofilizados encapsulados durante o armazenamento de um mês na Estação Espacial Internacional’ foi publicado na Scientific Reports (2018) 8:10687 – DOI:10.1038/s41598-018-29094-2.