Probiótico LcS nos sintomas depressivos
Estudo mostra efeitos benéficos do Lacticaseibacillus paracasei Shirota em pacientes com o transtorno
O transtorno depressivo, também conhecido como depressão, é um tipo de transtorno caracterizado por humores baixos persistentes. Os principais sintomas são longa duração da depressão, falta de motivação, perda de prazer e disfunção física. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a incidência global de depressão é de aproximadamente 4,4%. Notavelmente, estresse, hábitos alimentares e inatividade física têm implicado na etiologia da depressão. Já foi demonstrado que existem correlações entre depressão e doenças gastrointestinais e que indivíduos com desconforto intestinal têm maior risco de desenvolver o transtorno depressivo. Em uma pesquisa envolvendo 18.571 indivíduos, aqueles com desconforto gastrointestinal apresentaram maior prevalência de depressão do que a população geral (7,5% versus 2,9%), e a prevalência na população com pelo menos dois problemas de desconforto gastrointestinal foi de 13,4%. Uma metanálise de 35 estudos com 7.179 pacientes com síndrome do intestino irritável com predominância de constipação (SII-C) e 69.989 pacientes com constipação idiopática crônica (CIC) relatou que a incidência de depressão em ambos os grupos foi de até 12,5-69,2% e 14,6-29,2%, respectivamente. Quase todos os casos de depressão são acompanhados por sintomas gastrointestinais, e 83,5% dos pacientes com depressão apresentam sintomas de diarreia e constipação, que são os sintomas gastrointestinais mais comuns.
A patogênese da depressão envolve elementos disfuncionais em respostas neuroendócrinas, imunológicas, funções sinápticas e de plasticidade e neurogênese. Crescentes evidências sugerem que a microbiota intestinal desempenha papéis-chaves no desenvolvimento da depressão, e vários estudos sobre esse assunto estão em andamento atualmente. Kunugi e colaboradores relataram resultados sugerindo que contagens bacterianas baixas de Bifidobacterium e/ou Lactobacillus são mais comuns e maiores em pacientes com transtorno depressivo do que em controles saudáveis. Estudos sobre o eixo intestino-cérebro também foram conduzidos para determinar os efeitos da microbiota intestinal na depressão. Estudos em animais livres de germes (GF) relataram que a microbiota intestinal exerce funções em processos neurogênicos básicos, incluindo a formação da barreira hematoencefálica, mielinização, neurogênese e maturação da micróglia que, por sua vez, afetam os comportamentos dos animais. Em outro trabalho, camundongos que sofreram privação materna exibiram comportamentos ansiosos e depressivos, anormalidades nos níveis de hormônio do estresse corticosterona e disfunção intestinal. Além disso, os camundongos GF apresentaram níveis anormais de hormônio do estresse e disfunção intestinal após a privação materna, mas nenhum comportamento semelhante à ansiedade e à depressão.
Os probióticos regulam efetivamente a microbiota intestinal e aliviam doenças gastrointestinais, como diarreia e constipação. Uma metanálise recente de 1.349 indivíduos envolvidos em 10 intervenções com probióticos para a depressão revelou que estes, efetivamente, aliviaram os sintomas depressivos leves e moderados. A cepa Lacticaseibacillus paracasei Shirota (LcS) – anteriormente classificada como Lactobacillus casei Shirota – tem um histórico de mais de 80 anos de consumo seguro e benefícios comprovados para a saúde, e é apoiada por extensa pesquisa científica na redução de doenças intestinais funcionais e infecciosas e efeitos de modulação imunológica. A eficácia do LcS no alívio da constipação já foi demonstrada em vários estudos, que mostraram melhora na frequência de evacuações e na qualidade das fezes, aliviando a constipação.
O consumo de bebidas com LcS diminuiu a gravidade da constipação, melhorou a consistência das fezes e acelerou o trânsito colônico em pacientes com constipação crônica. O LcS também melhorou a consistência das fezes em indivíduos saudáveis, pacientes com doença de Parkinson, mulheres no puerpério e pacientes gastrectomizados. Assim, o LcS pode ter o potencial para melhorar a constipação em indivíduos com depressão. O LcS também melhorou as fezes duras durante a constipação, possivelmente, aumentando as bactérias produtoras de butirato e os níveis subsequentes de butirato nas fezes em 39,7%.
Um estudo recente revelou que o LcS aliviou a ansiedade induzida pelo estresse e diminuiu os níveis de cortisol salivar, disfunção abdominal, distúrbios do sono e outros sintomas físicos, e preservou a microbiota intestinal de populações saudáveis estressadas. No entanto, permanece incerto se o LcS exerce um impacto sobre os sintomas depressivos. O objetivo principal deste estudo foi investigar os efeitos do LcS na constipação em pacientes com depressão. O LcS tem demonstrado ser eficaz para a constipação em várias populações. Portanto, este estudo buscou investigar tais efeitos em pacientes com depressão que também podem ter uma etiologia e microbiota intestinal específicas. Como objetivo secundário, foi investigado os efeitos do LcS nos sintomas depressivos.
Materiais e métodos
Este foi um estudo paralelo de dois braços, randomizado, duplo-cego controlado por placebo (RCT). O tamanho da amostra necessária foi estimado com base nas pontuações do Índice de Depressão de Beck (BDI) de Akkasheh e colaboradores, considerando erro α de 0,05 e erro β de 0,20. Trinta voluntários foram necessários por grupo, mas 82 indivíduos foram recrutados para compensar a provável perda de acompanhamento. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da China Agricultural University (identificação do projeto de pesquisa nº CAUHR-2019014 em 3 de setembro de 2019). Este estudo foi registrado no http://www.chict.org.en (acessado em 16 de setembro de 2019) como ChiCTR190002 972. Os voluntários que assinaram o formulário de consentimento foram selecionados para elegibilidade de acordo com os critérios de inclusão e exclusão.
Critérios de inclusão: indivíduos com idade entre 18 e 60 anos no início do estudo; índice de massa corporal (IMC) 18,5 – 29,9; depressão diagnosticada por psiquiatras de acordo com os critérios diagnósticos para episódios depressivos do Manual Diagnóstico e Estatístico Americano de Transtornos Mentais (5ª Edição) (DSM-5); e um diagnóstico de constipação de acordo com os Critérios de Roma IV, incluindo dois ou mais sintomas seguintes: (i) esforço para mais de 25% das defecações, (ii) fezes grumosas ou duras em mais de 25% das defecações, (iii) sensação de evacuação incompleta em mais de um quarto (25%) das defecações, (iv) sensação de obstrução/bloqueio anorretal em mais de um quarto (25%) das defecações, (v) manobras manuais para facilitar mais de um quarto (25%) das defecações e (vi) menos de três evacuações espontâneas por semana. Além disso, uma escala de classificação de depressão de Hamilton (HAMD) de 17 itens de pontuação ≥ 8 é considerado como depressão.
Critérios de exclusão: uso de antibióticos sistêmicos ou antimicóticos nos 30 dias anteriores ao estudo; uso de medicação antidiarreica ou laxante nos 30 dias anteriores ao estudo; incerteza do investigador sobre a vontade ou capacidade dos voluntários de cumprir os requisitos do protocolo; pessoas com alergia à proteína do leite, intolerância à lactose ou problemas de constipação de origem orgânica ou neurológica; mulheres grávidas ou lactantes; uso de antidepressivos nas duas semanas anteriores ao estudo; voluntários em quaisquer outros estudos dentro de dois meses antes da entrada neste estudo.
Coleta de informações e cronograma
Na visita de triagem foram coletados dados demográficos, critérios de elegibilidade, histórico médico e medicamentos concomitantes. Todos os dados, exceto o histórico médico, foram obtidos a partir de questionários preenchidos pelos investigadores durante as visitas de triagem. Os voluntários foram randomizados uniformemente no grupo LcS ou placebo (1:1) estratificados pelo status da medicação. A randomização foi conduzida pela equipe do Dr. Guoshuang Feng (Centro Nacional de Saúde Infantil da China). Os indivíduos foram randomizados usando um processo de randomização em blocos gerado por computador para dois grupos em proporções iguais, usando o programa SAS versão 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).
As bebidas teste foram uma bebida láctea fermentada e um placebo. Cada frasco de 100ml da bebida láctea fermentada continha pelo menos 1,0×1010 UFC de Lacticaseibacillus paracasei YIT 9029 (cepa Shirota: LcS), água, açúcar, leite em pó desnatado, glicose e aromas. A composição nutricional de um frasco era de 287kJ de energia, 1,2g de proteína, 0g de lipídio, 15,7g de carboidratos e 19mg de sódio. O placebo continha os mesmos componentes da bebida láctea fermentada, mas não continha o probiótico. O sabor do placebo foi semelhante ao da bebida láctea fermentada pela adição de ácido lático. Sabor, aroma e aparência externa do placebo eram indistinguíveis daqueles das bebidas lácteas fermentadas. A bebida láctea fermentada e o placebo foram fabricados e distribuídos pela Yakult Corporation, Xangai, China. As bebidas foram mantidas refrigeradas até a ingestão.
O estudo consistiu em um período inicial de 14 dias, um período de ingestão de nove semanas e quatro visitas (V1-V4, com 21 dias de intervalo cada). Durante o período basal, os voluntários continuaram sua dieta normal, mas excluíram produtos lácteos fermentados. Em V1, V2 e V3, os participantes receberam 21 frascos de bebida láctea fermentada ou placebo. Os voluntários foram instruídos a beber um frasco após cada almoço e preencher um diário. Este compreendia perguntas sobre a ingestão do produto do estudo (somente para o período de ingestão de nove semanas), outras ingestões de alimentos, frequência de defecação, consistência das fezes, gravidade da constipação, escores de sintomas relacionados à constipação, medicação recebida e quaisquer outros sintomas de desconforto (diarreia, vômito, doença, entre outros).
Em V1 e V4 foram coletadas amostras de fezes e sangue. Os índices BDI e HAMD foram utilizados para avaliar o grau de depressão. Grau de depressão de acordo com as pontuações do BDI: 0 – 4= não, 5 – 7= leve, 8 – 15= moderado e >15= grave, e grau de depressão de acordo com as pontuações de 17 itens do HAMD: 0 – 7= não, 8 – 17= leve; 18 – 24= moderado e >24= grave. As pontuações do PAC-SYM foram usadas para avaliar a gravidade da constipação. O PAC-SYM de 12 itens foi dividido em três subescalas de sintomas: abdominal (itens 1 – 4), retal (itens 5 – 7) e fezes (itens 8 – 12). Os itens foram pontuados na escala Likert de 5 pontos, variando de 0 a 4 (0= sintoma ausente, 1= leve, 2= moderado, 3= grave e 4= muito grave). Os desfechos primários foram alterações nas pontuações do PAC-SYM. Os desfechos secundários incluíram mudanças na pontuação do BDI e HAMD, microbiota intestinal e parâmetros séricos.
Análise estatística
Além das análises da microbiota intestinal fecal, os dados foram relatados como média ± desvio padrão (DP), a menos que indicado de outra forma. As análises estatísticas foram realizadas usando SPSS Versão 21 (IBM Corp, Armonk, NY, EUA). Foi realizado teste qui-quadrado para gênero e testes t para análise de idade, peso e IMC. O teste de classificação sinalizada de Wilcoxon foi usado para comparar os dados entre as visitas, e o teste de soma de classificação de Wilcoxon foi usado para comparar grupos para sintomas relacionados à constipação, PAC-SYM e escores de depressão e, também, parâmetros séricos. P<0,05 foi considerado um indicativo de diferenças estatisticamente significativas.
Parâmetros do soro
O sangue foi coletado por uma enfermeira qualificada e centrifugado a 3500rpm por 10 minutos a 4°C. O soro foi coletado e armazenado a -80°C até a avaliação. Os fatores inflamatórios séricos interleucina (IL)-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) foram medidos por um kit comercial de ensaio imunoenzimático (ELISA) (ExCell Bio, Xangai, China), de acordo com as recomendações do fabricante.
Alterações na composição da microbiota intestinal
As análises de composição da microbiota foram realizadas na região V3-V4 do gene 16S rRNA utilizando o sequenciamento Illumina (Majorbio Bio Pharm Technology Co., Ltd., Xangai, China). Resumidamente, o DNA foi extraído de amostras de fezes de acordo com os protocolos do fabricante usando o E.Z.N.A. kit de DNA do solo (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EUA). A região V3-V4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Os primers 338F (5’-barcode ACTCCTACGG AG-GCAGCAG 3’) e 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) foram usados. Os PCRs foram conduzidos usando o seguinte programa: inicial 95°C por 3 minutos, seguido por 27 ciclos a 95°C por 30 segundos. 55°C por 30 segundos, 72°C por 45 segundos e uma extensão final a 72°C por 10 minutos. Os amplicons foram extraídos de géis de agarose a 2%, purificados (usando o AxyPrep DNA Gel Extraction Kit – Axygen Biosciences, Inc, Union City, CA, EUA), agrupados em concentrações equimolares e sequenciados em pares (2×250) na plataforma Illumina MiSeq (Illumina, Inc, San Diego, CA, EUA), de acordo com os protocolos padrão. As leituras brutas foram depositadas no banco de dados do National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive. Os arquivos raw fastq foram desmultiplexados e a qualidade filtrada usando o software Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME). Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs) foram agrupadas com um corte de similaridade de 97% usando UPARSE e sequências quiméricas identificadas e removidas usando análises UCHIME. Sequências alinhadas usando ClustalW2 foram usadas para construir uma árvore de junção vizinha do R com pacote ape. A árvore e a abundância de OTU foram então usadas para calcular as distâncias ponderadas do UniFrac do R com pacote R GUniFrac. OTUs com abundâncias proporcionais de pelo menos 0,1% em pelo menos três amostras foram retidas para a análise a jusante. A taxonomia de cada sequência do gene 16S rRNA foi analisada pelo classificador RDP contra o banco de dados Silva (SSU132) 16S rRNA usando um limite de confiança de 70%.
A abundância relativa de diferentes gêneros em cada amostra foi calculada e comparada entre visitas e grupos usando medições repetidas de ANOVA, usando estatísticas do pacote R (3.3.1). Os índices de Chao e Shannon foram calculados para avaliar a diversidade alfa. A análise de coordenadas principais (PCoA) com base nas distâncias de Bray Curtis de OTUs forneceu uma visão geral das diferenças microbianas intestinais entre os grupos. A análise de similaridade (ANOSIM) foi usada para comparar as distâncias ponderadas do UniFrac entre e dentro das visitas. O UniFrac ponderado é uma medida quantitativa de diversidade que detecta mudanças em quantas sequências de cada linhagem estão presentes, bem como detecta mudanças em quais táxons estão presentes. A detecção de táxons diferencialmente abundantes entre os dois grupos foi feita usando análise discriminante linear (LDA) Effect Size (LEfSe), e os valores de LDA ≥ 2 com um valor de P<0,05 foram considerados significativamente enriquecidos.
Resultados mostram benefícios
Um total de 82 indivíduos foi recrutado seguindo os critérios de inclusão – 69 completaram o estudo, com adesão de 84%. Não foram observados eventos adversos e diferenças significativas entre os grupos em relação à idade, peso, IMC, HAMD ou gênero. Após nove semanas de ingestão do produto foi observada uma redução significativa (P<0,05) nas pontuações totais do PAC-SYM: de 14,39± 9,67 para 5,87± 6,05 no grupo LcS, e de 15,00± 10,39 para 8,97± 7,87 no grupo placebo. Não foram observadas diferenças significativas, mas pontuações totais do PAC-SYM entre os grupos (P=0,055). Após a ingestão do LcS por nove semanas, os sintomas nos itens 1 – 12 do PAC-SYM foram significativamente aliviados, mas, no grupo placebo, apenas os sintomas nos itens 1, 6, 7 e 9 – 12 foram significativamente aliviados (P<0,05). Além disso, os sintomas no item 7 e a subescala de sintomas nas fezes (itens 8 – 12) foram mais significativamente aliviados no grupo LcS, quando comparados ao placebo (P<0,05). Esses resultados indicaram que os sintomas de constipação melhoraram após a ingestão do LcS quando comparados com o placebo ao longo de nove semanas.
Em relação aos sintomas relacionados à depressão na linha de base, os voluntários tiveram pontuações do BDI e HAMD significativamente mais altas do que no final do período de ingestão. No final do período de ingestão, as pontuações do BDI e HAMD foram todas diminuídas significativamente, e o grau de depressão melhorou significativamente em ambos os grupos (P<0,05). Esses resultados mostraram que o LcS e o placebo ajudaram a aliviar a depressão. Em relação às alterações na composição da microbiota intestinal, a diversidade-α da microbiota no nível de OTU foi identificada e o índice de Chao ou índice de Shannon não foi significativamente diferente entre os dois grupos. A diversidade-β da microbiota intestinal no nível da OTU foi identificada usando PCoA com base nas distâncias de Bray-Curtis. A composição microbiana global foi observada entre os dois grupos. No entanto, a diferença entre V1 e V4 do grupo LcS e V4 do grupo LcS e placebo foram menores, indicando que o LcS não alterou a diversidade-β da microbiota intestinal. Os filos mais abundantes foram Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria e Actinobacteria. Não houve diferenças significativas entre os grupos em V4.
A composição da microbiota intestinal em nível de gênero também foi analisada. Bactérias com uma abundância relativa de mais de 1% foram demonstradas em nível de gênero. Testes de Wilcoxon rank sum foram realizados para comparar diferenças nas comunidades bacterianas fecais entre os dois grupos em nível de gênero. Quando comparada com a linha de base, a abundância relativa de Adlercreutzia e Megasphaera aumentou significativamente após a intervenção com LcS por nove semanas, e a abundância relativa de Klebsiella, Tyzzerella_4 e Eggerthella diminuiu significativamente após a intervenção com placebo no mesmo período. Quando comparado ao placebo, a abundância relativa de Veillonella aumentou significativamente, e Rikenellaceae_C9_gut_group, Sutterella e Oscillibacter diminuíram significativamente após a intervenção com LcS por nove semanas. LEfSe foi usado para determinar, ainda, se táxons bacterianos específicos foram enriquecidos diferencialmente em V4 do grupo LcS e do grupo placebo. Usando um ponto de corte de pontuação LDA logarítmico de 2, 17 gêneros discriminatórios foram identificados como discriminantes-chave. Veillonella, Neisseria, Ralstonia e Eggerthella foram significativamente super-representadas nas fezes do grupo LcS, enquanto Rikenellaceae_C9_gut_group, Sutterella, Oscillibacter e Rothia foram enriquecidas no grupo placebo.
Citocinas inflamatórias do soro
As concentrações séricas de IL-1β, IL-6 e TNF-α foram investigadas para avaliar a inflamação. Os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α não apresentaram diferenças significativas entre os grupos placebo e LcS na linha de base. Após nove semanas da intervenção com LcS, os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α diminuíram significativamente. Além disso, os níveis de IL-6 foram significativamente mais baixos no grupo LcS do que no placebo no final do período de ingestão.
Primeiro estudo do gênero com pacientes depressivos
Até onde se sabe, este é o primeiro estudo probiótico duplo-cego, randomizado, placebo controlado para avaliar os sintomas de constipação em pacientes com depressão. Neste estudo foi confirmado que os sintomas de constipação, especialmente de fezes avaliados com PAC-SYM, foram aliviados pelo LcS. Além disso, o LcS diminuiu significativamente as pontuações de BDI e HAMD, embora as mudanças nos sintomas depressivos não tenham sido significativas entre os grupos. O LcS também diminuiu significativamente os níveis de IL-6 e regulou a microbiota intestinal associada à doença mental. O LcS é um probiótico amplamente utilizado e esta descoberta de que a constipação foi aliviada pelo uso da cepa foi consistente com estudos anteriores.
A função de alívio da depressão do LcS também foi confirmada, embora as mudanças nas pontuações de BDI e HAMD não tenham sido significativamente diferentes entre os grupos. Da mesma forma, evidências anteriores indicaram que os benefícios dos antidepressivos para o tratamento da depressão eram devidos à resposta ao placebo. Em um estudo randomizado controlado de 423 mulheres no período pós-parto foi relatado que pontuações de depressão acima do ponto de corte não foram significativamente diferentes entre os grupos de tratamento probiótico e placebo. Outra razão para seus estados depressivos (pontuações BDI e HAMD) melhorarem significativamente no grupo placebo foi que o mesmo continha leite, e já está relatado que mudanças positivas de saúde e humor foram associadas ao consumo de leite cru em um questionário para os consumidores.
A microbiota intestinal é essencial para a saúde e, recentemente, se tornou um alvo para bioterapias com células bacterianas vivas para várias doenças crônicas, incluindo constipação funcional e depressão. Neste estudo, muitos táxons foram encontrados diferencialmente abundantes entre os grupos LcS e placebo, conforme identificado pela soma de classificação de Wilcoxon e LEfSe. Quando comparada com a linha de base, a abundância relativa de Adlercreutzia e Megasphaera aumentou significativamente após a intervenção com LcS por nove semanas. Adlercreutzia é uma bactéria de produção igual, exibe efeitos benéficos e possui propriedades imunorreguladoras. Megasphaera produz ácido butírico. Veillonella usa lactato e o metaboliza em ácidos mais fracos como acetato e propionato.
Em estudo clínico recente para investigar os efeitos de uma bebida contendo o probiótico LcS na microbiota da placa dentária, a abundância relativa de Veillonella aumentou significativamente após a intervenção de 28 dias com LcS. Rikenellaceae está associada à esquizofrenia e a Sutterella é uma comensal amplamente prevalente, com capacidade pró-inflamatória leve no trato gastrointestinal humano e está associada a várias condições, como diabetes tipo 1 e doença inflamatória intestinal. Além disso, é um componente importante da microbiota em crianças com autismo e distúrbios gastrointestinais. A cepa padrão do Oscillibacter produz ácido valérico como seu principal produto final metabólico, um homólogo do neurotransmissor ácido gama aminobutírico (GABA), e apresenta associação significativa com depressão. Assim, a intervenção com LcS por nove semanas aumentou os microrganismos benéficos Adlercreutzia, Megasphaera e Veillonella e diminuiu as bactérias relacionadas à doença mental, como Rikenellaceae_ C9_gut_group, Sutterella e Oscillibacter.
As citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α foram previamente relatadas como elevadas em pacientes com depressão e parecem desempenhar papéis significativos na patogênese de uma depressão maior. Além disso, essas citocinas influenciaram a integridade da barreira intestinal e a atividade do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal e o metabolismo do triptofano na via das quinureninas. IL-6 liberada na periferia e/ou no sistema nervoso central exerceu efeitos na resposta comportamental ao lipopolissacarídeo (LPS) e IL-1 que se desenvolveu em resposta à inflamação sistêmica. Neste estudo, as reduções nas citocinas pró-inflamatórias podem ser consistentes com as reduções da bactéria pró-inflamatória Sutterella.
Este estudo teve várias limitações. Primeiro, não foram observadas diferenças significativas nas pontuações de BDI e HAMD entre os grupos. Os efeitos benéficos do LcS na depressão não foram claramente demonstrados, embora tenham sido observadas reduções nas pontuações de BDI e HAMD no grupo LcS, quando comparado ao grupo placebo. Em segundo lugar, este estudo careceu de uma análise de metabólitos da microbiota intestinal. Portanto, o mecanismo preciso do LcS permanece desconhecido e mais estudos de metabólitos da microbiota intestinal são necessários para esclarecer esses mecanismos. O estudo ‘Effects of Fermented Milk Containing Lacticaseibacillus paracasei strain Shirota on Constipation in Patients with Depression: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial’ foi publicado no periódico Nutrients 2021, 13, 2238: https://doi.org/10.3390/nu13072238.