O papel da microbiota na doença de Crohn
Com metodologias inovadoras é possível analisar o ambiente intestinal de pacientes e comparar com indivíduos saudáveis
Os primeiros relatos de doença de Crohn datam de 1913, mas foi somente em 1932 que o médico norte-americano Burril Bernard Crohn descreveu a enfermidade, inicialmente chamada de ileíte terminal e, depois, batizada com o sobrenome do seu descobridor. O Crohn é uma das formas mais graves de doença inflamatória intestinal (DII), cuja incidência vem aumentando nos últimos anos, especialmente nos países subdesenvolvidos. As DII – Crohn e retocolite ulcerativa – são comuns em países ricos, principalmente Canadá, Estados Unidos, Austrália e na Europa. Na América do Sul, a incidência é de três para cada 100 mil indivíduos/ ano e, no Brasil, os casos vêm crescendo em algumas regiões, especialmente aquelas com herança europeia, como o Sul. Já está descrito que a etiologia da enfermidade envolve interações complexas entre a microbiota intestinal e a regulação do sistema imunológico, e algumas pesquisas tentam identificar se determinadas espécies de bactérias intestinais podem estar envolvidas no desenvolvimento ou no agravamento da doença.
Um desses estudos foi publicado na Scientific Report, da Nature Research, em outubro de 2019, com o título ‘Remission in Crohn’s disease is accompanied by alterations in the gut microbiota and mucins production’. Um grupo de pesquisadores da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (FCM-Unicamp) analisou, de maneira inédita, a microbiota intestinal de 18 pacientes com doença de Crohn em remissão e 18 familiares saudáveis moradores da mesma casa, com idade superior a 50 anos, que formaram o grupo controle. “Até agora, estudos deste tipo tinham sido desenvolvidos apenas com controles saudáveis oriundos de bancos de dados, mas a nossa pesquisa teve o objetivo de identificar se a microbiota intestinal dos indivíduos sem doença de Crohn que viviam na mesma residência de um paciente tinha alguma diferença”, conta a nutricionista Daniéla Magro, pesquisadora do Departamento de Cirurgia da FCM-Unicamp, que desenvolveu o estudo durante o pós-doutorado entre junho de 2016 e maio de 2017.
A literatura mostra que a microbiota das pessoas que residem na mesma casa é muito similar, uma vez que ambiente, alimentação, condições de higiene, animais de estimação, água e até mesmo a temperatura da casa têm forte influência na colonização intestinal. No entanto, ao comparar a microbiota do grupo controle e dos pacientes, os pesquisadores encontraram muito mais similaridade entre os indivíduos saudáveis (moradores de casas diferentes), enquanto os que tinham doença de Crohn apresentavam grande quantidade de bactérias do filo Proteobacteria, relacionado à inflamação intestinal. Para a análise, os pacientes passaram por exame de colonoscopia realizado pelo professor doutor Cláudio Saddy Rodrigues Coy – coordenador da pesquisa –, e todos os participantes fizeram a coleta das fezes para extração do DNA e sequenciamento da microbiota.
“Teoricamente, se a pessoa mora no mesmo ambiente a microbiota deveria ser similar, lembrando que a flora muda até mesmo de acordo com o período do dia. O difícil é explicar a doença de Crohn baseada somente nisso. Se entendemos que a enfermidade é desencadeada por um estímulo de antígeno que vem da microbiota, isso significa que a doença pode perpetuar uma alteração nessa microbiota que mantém a inflamação, e o ambiente não altera isso”, ressalta o professor. Como o ambiente não mudou a microbiota dos pacientes – que continuaram com alteração em relação às pessoas saudáveis moradoras do mesmo domicílio –, os pesquisadores entendem que o indivíduo com doença de Crohn tem realmente uma condição que perpetua a alteração microbiana, embora ainda não saibam se isso é causa ou consequência da enfermidade.
Diversidade de espécies bacterianas era menor nos pacientes
A microbiota intestinal é composta principalmente por bactérias, mas também tem fungos, arqueobactérias e vírus, e existem cinco grandes filos relacionados a esse ambiente intestinal: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria e Verrucomicrobia. Em geral, o que se observa é que pacientes com a doença de Crohn em atividade têm uma microbiota com maior percentual de Proteobacteria e menor percentual de Verrucomicrobia, filo que diminui a permeabilidade da mucosa intestinal e é representado pelo gênero Akkermansia. A nutricionista Daniéla Magro acrescenta que, quando um indivíduo tem alguns tipos de tumores gastrointestinais ou doença inflamatória intestinal, é comum ter Proteobacteria em maior proporção. “As Proteobacteria fazem parte da microbiota, só que em uma quantidade menor quando comparado com indivíduos doentes. Quanto mais Proteobacteria, mais inflamação intestinal, mais permeável fica o intestino devido à diminuição da camada de muco, e o paciente vai ter mais aumento de lipopolissacarídeo (LPS) circulante, um dos componentes principais da membrana exterior de bactérias gram-negativas”, detalha.
Pacientes com doença de Crohn em atividade têm seis vezes mais LPS sérico quando comparados aos indivíduos em remissão, que têm duas vezes mais lipopolissacarídeos do que as pessoas saudáveis. Maiores concentrações de LPS contribuem para manter a inflamação, principalmente por ativar a cascata inflamatória do sistema imune inato. Além de a proporção das bactérias do filo Proteobacteria ter sido maior no grupo com doença de Crohn analisado no estudo, os pacientes tinham uma menor quantidade de bactérias da classe Deltaproteobacteria e do gênero Oscillospira. “Mesmo tendo hábitos alimentares diferentes, esses pacientes tinham uma menor alfa-diversidade, ou seja, o número de espécies de bactérias no intestino era menor. Entre os pacientes com Crohn a alfa-diversidade era heterogênea, enquanto no grupo controle era mais homogênea, mesmo em famílias diferentes”, relata o professor doutor Andrey dos Santos, biólogo do Laboratório de Investigação Clínica em Resistência à Insulina da FCM-Unicamp, onde as amostras foram analisadas.
O grupo também avaliou a mucina da mucosa intestinal, mostrando que esses pacientes têm alteração, e o fungo Saccharomyces cerevisiae – um dos principais na microbiota –, que também estava em menor quantidade nos indivíduos com a doença quando comparados com os controles. Segundo os autores, uma das implicações dessa diversificação de espécies é saber como é possível pensar no uso de probióticos para esses pacientes. “Não adianta pensarmos que fazer suplementação de Saccharomyces, por exemplo, vai melhorar a microbiota desses indivíduos, porque tudo tem de estar em equilíbrio. O uso de probiótico de livre demanda não é recomendado para pessoas com doença de Crohn, porque não sabemos que bactéria está faltando naquela microbiota”, orienta o biólogo Andrey dos Santos. Mesmo indivíduos saudáveis podem ter espécies diferentes de bactérias que produzem o mesmo tipo de metabólito. Além disso, o sistema imune do intestino precisa estar preparado para receber um determinado tipo de bactéria ou um conjunto de bactérias probióticas para que tenha o efeito benéfico esperado.
O grupo pretende desenvolver um projeto com gestantes com DII para avaliar a microbiota durante a gestação e após o nascimento, e ver qual é a influência da microbiota materna no recém-nascido. Os pesquisadores também pretendem fazer um experimento utilizando uma cápsula de butirato – um ácido graxo de cadeia curta – para tentar aumentar a energia fornecida para as células intestinais, melhorando a barreira intestinal e o sistema imune dos pacientes com doença de Crohn. A meta é saber se a cápsula vai chegar ao intestino, se vai alimentar as bactérias anti-inflamatórias e se isso vai melhorar a microbiota. “O butirato tem efeito benéfico para a microbiota, mas o grande problema é como fazer com que chegue nesse microambiente”, acentua a nutricionista. O estudo está disponível no https://www.nature.com/articles/s41598-019-49893-5.
Impacto potencial de proteínas microbianas
Por meio de vias de sinalização e redes de interação moduladas a partir de dados de metagenômica e metaproteômica, uma pesquisa de doutorado desenvolvida na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) e no Earlham Institute, na Inglaterra, conseguiu analisar assinaturas de interação baseadas em dados estruturais e moleculares de proteínas humanas e microbianas expressadas unicamente em pessoas com doença de Crohn. O principal objetivo do estudo foi avaliar a relação das doenças inflamatórias intestinais com a microbiota com enfoque molecular, analisando como a interação entre as proteínas das bactérias e as humanas podem desencadear, agravar ou melhorar a doença a partir da alteração de processos celulares. Com base na informação de que o indivíduo que desenvolve a doença de Crohn apresenta diferenças de expressão em alguns genes específicos – muitas vezes genes de reconhecimento bacteriano, de inflamação e da própria regulação imunológica – a bióloga doutora Tahila Andrighetti utilizou uma abordagem computacional integrada para acessar o impacto potencial de proteínas microbianas presentes em pacientes com doença de Crohn e em indivíduos saudáveis.
Para o estudo in silico realizado com ferramentas de biologia de sistemas, a pesquisadora desenvolveu um software para análise da interação entre microbioma e hospedeiro, que foi aplicado para o estudo do microbioma de indivíduos com doença de Crohn e saudáveis (controle). Para a análise foram utilizados dados de transcriptomas humanos – conjuntos de RNAs mensageiros expressos em determinadas condições, que mostram as diferenças de expressão entre genes de indivíduos com a doença em comparação aos saudáveis. Esses dados foram utilizados para analisar como as proteínas das bactérias que interagem com as proteínas humanas causam defeitos em processos biológicos que levam à enfermidade. Ao fazer a comparação entre o microbioma intestinal de indivíduos saudáveis e com a doença, o software mostra possíveis vias que regulam os genes que estão mais ou menos expressos nos dois grupos.
O conjunto de dados de proteínas microbianas foi obtido de um estudo sueco de 2012 que identificou diferenças metaproteômicas entre duplas de gêmeos, das quais apenas um foi diagnosticado com doença de Crohn. “Comparando os pares de gêmeos entre si foi possível desprezar a variabilidade genética como principal fator para a doença, pois nosso objetivo era dar enfoque ao efeito do microbioma. Também foram determinadas as vias de sinalização e os processos biológicos em potencial, pelos quais genes de autofagia – um processo de reciclagem de organelas e bactérias que, quando diminuído, pode estar relacionado com o desenvolvimento de doença de Crohn – podem ser afetados pela ligação das proteínas microbianas aos receptores humanos”, detalha.
Com uso do sistema computacional, a pesquisadora procurou informações difíceis de serem respondidas no nível experimental. Ao descobrir que algumas proteínas bacterianas estão em alta nas pessoas com doença de Crohn, foi feita simulação computacional para saber como interagem com as proteínas da membrana celular. Em seguida, avaliou se essas proteínas poderiam estar sinalizando para o núcleo da célula e fazendo a expressão ser modificada. “Pegamos um banco de dados de redes proteicas que já estão descritas na literatura e fizemos algumas filtragens utilizando parâmetros matemáticos para ver quais são realmente as vias relevantes. Vimos que, além da autofagia, havia genes que podem estar auxiliando no aumento da apoptose, um mecanismo de morte celular programada que é visto aumentado em células da doença de Crohn. Com isso, ocorre mais morte celular e isso faz com que a mucosa se desproteja cada vez mais”, ressalta.
No funcionamento normal da mucosa intestinal, as células se renovam em suas vilosidades e, quando ficam mais velhas, são destacadas do tecido e jogadas para fora, no lúmen intestinal, enquanto outras se formam e migram para cima da vilosidade. Essa diferenciação celular envolve células de Paneth e células Goblet de maneira estratégica para que o funcionamento do intestino seja normal e a barreira se mantenha intacta. “Na doença de Crohn, as células morrem com mais frequência e não conseguem se proliferar a tempo. Isso faz com que a barreira fique desprotegida, mais bactérias entrem no tecido intestinal e acabam aumentando a inflamação. Como alguns indivíduos com doença de Crohn têm alguns genes de imunidade mutados, além de o intestino ficar mais permeável, essas bactérias entram na mucosa e não são combatidas pelo sistema imunológico”, acrescenta. Uma vez que as células que morrem vão para o lúmen e a autofagia está em baixa, as mesmas não conseguem ser recicladas e degradadas e, assim, fica uma grande quantidade de células mortas no lúmen, o que também aumenta a inflamação.