LcS e microbiota na doença hepática alcoólica
Estudo desenvolvido na China mostrou que a suplementação do Lactobacillus casei pode melhorar o metabolismo lipídico e regular os distúrbios da microflora intestinal
A doença hepática alcoólica (DHA) consiste em uma série de doenças hepáticas causadas pelo consumo excessivo de álcool por longo prazo e tornou-se um problema de saúde pública internacional. O distúrbio do metabolismo lipídico costuma ocorrer em pessoas com lesão hepática alcoólica, e os tratamentos são principalmente combinações de abstinência ao álcool, melhoria da nutrição, tratamento da lesão hepática e prevenção ou reversão do progresso da fibrose hepática, ou promoção da regeneração hepática. Os probióticos desempenham papel importante na regulação da microbiota intestinal. Verificou-se que distúrbios microecológicos intestinais e endotoxemia causados pela ingestão excessiva de álcool também desempenham um papel importante na ocorrência e no desenvolvimento de lesão hepática induzida pelo álcool. Estudos demonstraram que a suplementação adequada de probióticos pode desempenhar um bom papel terapêutico na reparação da lesão da mucosa intestinal, protegendo o fígado e prevenindo câncer e depressão. A maioria desses estudos é em modelos de roedores ou em população de fígado gorduroso não alcoólico, e a maioria deles usa lactobacilos como uma intervenção.
Existem poucos estudos sobre o efeito da intervenção de Lactobacillus casei em pacientes com DHA. Portanto, para preencher a lacuna e confirmar os resultados de estudos observacionais, um grande ensaio clínico randomizado com Lactobacillus casei em pacientes com DHA é altamente necessário. Este estudo foi desenhado como um ensaio randomizado, duplo-cego e placebo controlado. A distribuição aleatória foi realizada por um dos investigadores que não estava envolvido no ensaio, usando números aleatórios gerados por computador. Durante a intervenção, nem os participantes nem os enfermeiros/médicos do centro de estudo sabiam dos tipos de probióticos. A sequência de alocação foi gerada por médicos/enfermeiros no centro de pesquisa e os participantes foram designados aos grupos de intervenção. Todos os participantes, membros da equipe e avaliadores de resultados foram cegados para as atribuições do estudo até que as análises finais fossem concluídas. O estudo foi registrado no Comitê de Ética Médica do CDC de Qingdao (DIC2014J3). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
Os homens chineses geralmente têm mais oportunidades sociais de beber do que as mulheres. Por outro lado, a responsabilidade tradicional das chinesas adultas é administrar a vida diária de suas famílias, o que mantém as mulheres ocupadas nessas funções. As mulheres também não possuem tantas oportunidades de participar de compromissos sociais quanto os homens. Assim, a delegação de responsabilidades familiares restringe as mulheres de consumir álcool com frequência. Por isso, há uma grande disparidade no consumo de álcool e nas taxas de dependência entre os sexos na China, com taxas de transtorno do uso de álcool de 9,3% entre os homens e 0,2% entre as mulheres, com a proporção de 47:1 de homens para mulheres, sendo substancialmente maior do que na maioria dos países do mundo. A pesquisa preliminar também descobriu que não havia pacientes ambulatoriais do sexo feminino na clínica.
Os critérios de inclusão para o estudo foram: pacientes de 30 a 65 anos que atenderam aos critérios das Diretrizes de Diagnóstico e Tratamento de Doença Hepática Alcoólica (Revisão de 2018); aqueles que não haviam consumido bebida com probióticos recentemente poderiam aderir à suplementação de probióticos por dois meses e preencher os principais indicadores de observação; aqueles que se ofereceram para participar e assinaram o consentimento informado; e pacientes diagnosticados com fígado gorduroso alcoólico por ultrassom B. Os critérios excluíram mulheres, menores de 30 anos ou maiores de 65 anos, pacientes com recaídas durante o tratamento, pacientes com complicações graves, tais como cardiovascular, cerebrovascular, fígado e sistema hematopoiético ou com fibrose hepática alcoólica, cirrose hepática alcoólica e carcinoma hepatocelular, pacientes com doença mental que não podem cooperar e aqueles que não atendem aos critérios de inclusão e não podem julgar a eficácia ou segurança devido a dados incompletos.
Número de participantes e distribuição da amostra
Foi utilizado o índice de função hepática como desfecho primário, conforme mostrado em um estudo anterior, e 43 indivíduos foram necessários para cada grupo para atingir 80% de poder de detecção de um efeito de tratamento em nível de significância bilateral de 5%. Com 11 desistências em cada grupo, foi determinado um tamanho de amostra final de pelo menos 54 pessoas por grupo para permitir avaliar o resultado primário. Foram selecionados 193 adultos potenciais com DHA conhecida nos centros de estudo, entre março de 2016 e dezembro de 2017 – 181 foram recrutados com base nos critérios de inclusão e exclusão.
O grupo controle positivo (PC/n=46) recebeu tratamento de rotina e 100ml de bebida placebo uma vez ao dia; o grupo intervenção de baixa dose de Lactobacillus casei (LP/n=58) recebeu o tratamento de rotina e 100ml de LcS (10 bilhões) uma vez ao dia; o grupo intervenção de alta dose de Lactobacillus casei (HP/n=54) recebeu um tratamento de rotina e 100ml de LcS duas vezes ao dia; e 20 homens saudáveis foram selecionados como grupo controle normal (NC). Durante a intervenção, 14 participantes do grupo PC, três do grupo LP e seis do grupo HP desistiram dos ensaios por consumir álcool ou comer alimentos contendo probióticos, deixando 46, 58 e 54 participantes nesses grupos, respectivamente.
Os pacientes em cada grupo tomaram o suplemento diário após as refeições durante 60 dias. Todos receberam uma dose semanal de bebida no início do estudo e a dose da semana seguinte quando retornaram ao centro de estudos para exame de saúde, uma semana após a intervenção. A adesão ao suplemento foi avaliada indiretamente por meio da contagem dos frascos vazios trazidos todas as semanas e verificação dos diários de dieta (para verificar se consumiram alimentos contendo probióticos). No início da pesquisa, todos os participantes forneceram três registros alimentares (um dia de fim de semana e dois dias de semana). Com base nesses diários alimentares de três dias, a ingestão média de nutrientes de cada participante foi calculada pelo Sistema de Nutrição da Medicina Tradicional Chinesa Combinando com a Medicina Ocidental (versão 11.0).
Foi solicitado aos participantes não mudar hábitos alimentares, atividades físicas ou uso de medicamentos prescritos, e evitar o uso de quaisquer suplementos de probióticos a não ser o fornecido pelos pesquisadores. Também foram orientados a consumir as preparações probióticas e preencher o formulário de registro alimentar por telefone. Doses perdidas e seus motivos foram registrados. Os métodos de rastreamento foram principalmente por ligações telefônicas: conselhos psicológicos, melhora da confiança dos pacientes, lembretes para manterem a abstinência ao álcool e seus diários de dieta atualizados (evitando usar outros probióticos), informação regular para retornar ao exame de saúde e tomar os suplementos para a semana seguinte.
Seleção das dosagens e preparação da bebida
Referindo-se às dosagens dos estudos in vivo nacionais e estrangeiros que continham a cepa Lactobacillus casei Shirota (LcS) a 200 × 108/200ml por dia, 400 × 108/80ml por dia, 400 × 108/80ml por dia, respectivamente, os pacientes no pré-experimento receberam dois frascos/dia da bebida contendo LcS a 200 × 108/200ml e não ocorreram reações adversas gastrointestinais como vômitos, diarreia e prisão de ventre, sendo a dose máxima fixada em dois frascos/dia. O grupo de baixa dose recebeu um frasco/dia da bebida contendo LcS a 100 × 108/100ml para observar o efeito da intervenção. Essa dosagem garantiria a segurança deste estudo.
O leite fermentado e o placebo (ambos com 100ml/frasco) foram utilizados como bebidas teste no estudo. Os ingredientes do leite fermentado eram água, açúcar, leite desnatado, glicose, aromatizantes e Lactobacillus casei. O conteúdo nutricional por frasco (100ml) foi de 68kcal de energia, 1,2g de proteína, 15,7g de carboidrato e 15mg de sódio. O leite fermentado continha 10 bilhões ou mais de Lactobacillus casei. O placebo foi preparado com os mesmos ingredientes, de modo que tinha o mesmo conteúdo nutricional e sabor da bebida de leite fermentado, exceto pelo fato de não conter Lactobacillus casei.
OS PARÂMETROS ANTROPOMÉTRICOS foram medidos por médicos bem treinados no início do estudo. O peso e a altura dos pacientes foram registrados quando estavam usando roupas leves e sem sapatos, e o índice de massa corporal (IMC) foi calculado como o peso do participante (kg) dividido pelo quadrado da altura em pé (m). O kit quantitativo de lisado de limulus com matriz cromogênica foi obtido de Xiamen Limulus Reagent Laboratory Co., Ltd.; o kit de extração de DNA do genoma bacteriano foi obtido de Shanghai QIAgen; o kit de detecção de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real foi obtido de Beijing TIANGEN e o primer a síntese foi confiada à biossíntese de Shanghai. Também foram usados analisador bioquímico automático Beckman AU5400 (Beckman, EUA) e PCR quantitativo fluorescente Realplex 4 (Eppendorf, Alemanha).
AMOSTRAS DE SANGUE em jejum foram coletadas no início e após a intervenção de 60 dias. Análises do índice de função hepática sérica (alanina aminotransferase [ALT], aspartato aminotransferase [AST], gama glutamiltransferase [GGT], bilirrubina total [TBIL], bilirrubina direta [DBIL] e bilirrubina indireta [IBIL]) e perfil lipídico (colesterol total [TC], triglicerídeo [TG], colesterol de lipoproteína de alta densidade [HDL-C] e colesterol de lipoproteína de baixa densidade [LDL-C]) foram medidos usando kits disponíveis comercialmente no analisador bioquímico automático Beckman AU5400. O nível de endotoxina no plasma foi detectado pelo kit quantitativo de lisado de limulus com matriz cromogênica. Todos os recipientes foram tratados com pirogênio a 180°C por 24 horas e operados estritamente de acordo com as instruções do kit.
KITS DE ENSAIO: o kit ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática – Cloud-Clone Corp, Katy, EUA) foi usado para determinar interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-10 (IL-10) no soro, ácido D-láctico (D-LA), níveis de proteína de ligação de ácido graxo intestinal (I-FABP) e atividade de diamina oxidase (DAO) no plasma, de acordo com as instruções do fabricante.
Regulada após a ativação de células T normais expressas e secretadas (RANTES) e proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) foram medidas por imunoensaios enzimáticos usando anticorpos emparelhados ou kits disponíveis comercialmente.
A ANÁLISE DA MICROBIOTA INTESTINAL foi feita pelo DNA do genoma, extraído de amostras de 100mg de fezes e armazenado a −20°C. O conteúdo do DNA do genoma bacteriano foi quantificado pelo método da reação em cadeia da polimerase (PCR) de quantificação por fluorescência em tempo real, envolvendo Escherichia coli, Enterococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides fragilis e Clostridium tender. O sistema de reação e as condições de reação são semelhantes à curva padrão. De acordo com as instruções dos fabricantes, toda a sequência foi amplificada para PCR fluorescente em tempo real com o kit (QIAgen, Shanghai, China).
A ANÁLISE ESTATÍSTICA foi realizada no SPSS (versão 18; Chicago, IL, EUA). ANOVA unilateral ou teste de qui quadrado foi realizado para testar a diferença do grupo. P (bicaudal) <0,05 foi considerado significativo. O teste t-pareado de Student foi usado para testar a diferença nos marcadores antes e depois da intervenção. Análise de Pearson e Spearman foi utilizada para analisar a correlação. Foram conduzidos modelos lineares generalizados (GLM) no Stata (versão 13; StataCorp, College Station, TX, EUA). O GLM foi usado para testar a diferença entre os grupos, com ajuste para idade, IMC, função hepática, metabolismo lipídico e fator inflamatório para avaliar os efeitos do suplemento em todos os desfechos entre os grupos.
Resultados contêm inúmeros índices
Não houve diferença significativa em lipídios do sangue, função hepática, fatores inflamatórios ou quantitativos das seis bactérias entre os participantes dos três grupos de intervenção no início do estudo. Nenhuma diferença significativa na energia total e nos outros nutrientes da dieta foi encontrada entre os grupos nas avaliações da dieta de três dias no início do estudo. Todos os pacientes foram selecionados para risco nutricional com o Nutritional Risk Screening 2002 (NRS2002) e houve 47 deles (29,75%) com IMC <18,5; 77 (48,73%) com IMC entre 18,5 e 23,9, e 34 (21,52%) com IMC ≥ 24. Houve 57 pacientes (36,08%) com NRS ≥ 3.
Os níveis séricos de ALT, AST, TBIL, GGT, TG, TC e LDL-C no grupo PC aumentaram significativamente em relação ao grupo NC (P<0,05); os níveis séricos de TG, TC e LDL-C no grupo PC aumentaram 88,2%, 21,1% e 27,6%, respectivamente (P<0,05). Os níveis séricos de TG e LDL-C no grupo HP diminuíram significativamente em 26,56% e 23,83%, respectivamente, comparado ao grupo PC (P<0,05) após o tratamento. O teste t-pareado na função hepática entre a linha de base e o desfecho mostrou que TBIL no grupo PC; AST no grupo LP; ALT, AST, GGT e TBIL no grupo HP diminuíram significativamente em 25,98%, 37,78%, 31,14%, 41,53%, 22,22% e 34,77%, respectivamente (P<0,05). O teste t-pareado no metabolismo lipídico entre a linha de base e o ponto final mostrou que TG e LDL-C no grupo HP foram significativamente reduzidos em 29,85% e 21,52% (P<0,05).
Em comparação com o grupo NC, os níveis séricos de TNF-α e IL-6 nos grupos PC, LP e HP aumentaram significativamente (P<0,05), e os níveis séricos de IL-10 no grupo HP também aumentaram significativamente (P<0,05). Os níveis séricos de RANTES no grupo PC, LP e HP e os níveis séricos de MCP-1 no grupo PC aumentaram significativamente (P<0,05). Houve diferenças significativas entre os grupos após a intervenção (P<0,05). Em comparação com o grupo NC, os níveis de D-lactatos, endotoxina, I-FABP e DAO no plasma aumentaram significativamente no grupo PC (P<0,05). Os níveis de endotoxina, I-FABP e DAO no grupo HP foram significativamente reduzidos em 54,17%, 33,93% e 38,78%, respectivamente, em comparação àqueles do grupo PC (P<0,05). O nível de DAO no grupo HP diminuiu significativamente em 26% em relação ao grupo LP (P<0,05).
A quantidade de Lactobacillus no grupo PC foi significativamente reduzida em 20,7%, se comparada ao grupo NC (P<0,05), e a quantidade de Escherichia coli, Enterococcus, Bifidobacterium, Bacteroides e Clostridium leptum não apresentou diferença significativa em comparação ao grupo NC (P>0,05). Após a suplementação de Lactobacillus casei, as quantidades de Lactobacillus e Bifidobacterium no grupo LP aumentaram significativamente em 15,3% e 19,9%, se comparado ao grupo PC (P<0,05). A quantidade de Lactobacillus e Bifidobacterium no grupo HP aumentou significativamente em 39,5% e 43,6%, quando comparadas ao grupo PC (P<0,05).
Não houve diferença significativa na quantidade de Escherichia coli, Enterococcus, Bacteroides e Clostridium leptum em comparação com o grupo PC (P>0,05). Na análise de correlação da função hepática, metabolismo lipídico e probióticos, o ALT foi positivamente correlacionado com TG e LDL-C (r=0,455 e 0,373, P<0,05); o AST foi positivamente correlacionado com TG, TC e LDL-C (r=0,483, 0,339 e 0,507, P<0,05); o TG foi positivamente correlacionado com TBIL, DBIL e IBIL (r=0,416, 0,411 e 0,321, P<0,05). Nenhuma correlação significativa foi observada entre a função hepática, o perfil lipídico e a microflora intestinal.
Discussão mostra pontos fortes do experimento
No presente estudo, o teste t-pareado no metabolismo lipídico entre a linha de base e o ponto final mostrou que TG e LDL-C no grupo HP foram significativamente diferentes antes e depois da intervenção (P<0,05), e os TG e LDL-C séricos nos pacientes tratados com suplemento de Lactobacillus casei diminuíram significativamente se comparados com o grupo controle positivo (P<0,05). Após a suplementação de Lactobacillus casei houve aumento significativo nas quantidades de Lactobacillus e Bifidobacterium. Descobriu-se que o suplemento de Lactobacillus casei melhorou o metabolismo lipídico e regulou os distúrbios da microbiota intestinal em pacientes com lesão hepática alcoólica no experimento de dois meses. Em vários outros estudos, os autores sugeriram que os distúrbios da microbiota intestinal podem ser o fator inicial de lesão hepática alcoólica e desempenhar um papel fundamental em sua ocorrência e desenvolvimento. O álcool destrói o equilíbrio dos microrganismos intestinais e torna vantajosa a colonização e reprodução de bactérias patogênicas. Inokuchi e colaboradores descobriram que o álcool promoveu o crescimento de bactérias Gram negativas no trato intestinal, como Proteus, reduzindo assim a quantidade de bactérias anaeróbias, como as bifidobactérias.
Este estudo comprovou que, após a suplementação de Lactobacillus casei, as bifidobactérias aumentaram significativamente em pacientes com doença hepática alcoólica. A melhoria da microecologia intestinal pode inibir o estresse oxidativo, aliviar a inflamação do fígado e acelerar o metabolismo lipídico. Os resultados mostraram que o metabolismo lipídico melhorou após a intervenção, e a diminuição do TG e do LDL-C pode ser atribuída às evidências mencionadas. A abstinência ao álcool é a abordagem mais eficaz para atenuar ou cessar a lesão hepática relacionada ao álcool. Todos os pacientes recrutados foram convidados a se abster de beber e, desta forma, especula-se que pode ser por isso que todos os índices de função hepática diminuíram no grupo PC. O resultado mostrou que TBIL no grupo PC; AST no grupo LP, ALT, AST, GGT; e TBIL no grupo HP foram significativamente diferentes antes e após a intervenção (P<0,05) e houve diferenças significativas entre os grupos após a intervenção (P<0,05), indicando que a suplementação do Lactobacillus casei pode melhorar a função hepática. Consistente com esses achados, outros dois estudos mostraram que o Lactobacillus pôde melhorar a lesão hepática alcoólica.
Fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucinas IL-1β e IL-6 são considerados indicadores importantes que refletem a gravidade das reações inflamatórias e desempenham um papel vital na ocorrência e no desenvolvimento de lesão hepática. Por um lado, o TNF-α tem efeito citotóxico direto, causando necrose de hepatócitos; por outro, pode causar distúrbio da microcirculação levando à necrose de hepatócitos. Ao mesmo tempo, também interage com outros fatores inflamatórios, como a IL-6, para agravar ainda mais a lesão hepática. Os resultados deste estudo mostraram que, após lesão hepática alcoólica, os níveis de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaram significativamente e que houve inflamação em pacientes com lesão hepática alcoólica. A IL-10 é um fator anti-inflamatório eficaz e uma de suas principais funções é limitar a inflamação. Estudos anteriores mostraram que a IL-10 desempenha um papel fundamental na regulação da produção de TNF-α e na redução da inflamação. Este estudo também descobriu que a IL-10 no grupo HP foi significativamente aumentada se comparado ao grupo NC. Após a intervenção, houve diferenças significativas para os marcadores inflamatórios entre os grupos, sugerindo que o efeito protetor do Lactobacillus casei sobre a lesão hepática pode estar associado à redução dos níveis dos fatores inflamatórios.
O eixo intestino-fígado faz com que os distúrbios microecológicos intestinais e os danos à função da barreira intestinal se tornem uma importante patogênese da lesão hepática alcoólica. Este estudo sugeriu que a suplementação de L. casei poderia inibir o aumento da endotoxina, D-lactatos, IFABP e DAO que é causado pelo álcool. Além disso, alguns estudos sugerem que a suplementação de probióticos para pacientes com DHA pode manter a função normal da barreira intestinal, reconstruir o equilíbrio dos microrganismos intestinais e prevenir a translocação e inflamação bacteriana intestinal. Seguindo a linha desses estudos, os presentes resultados sugerem que a suplementação de Lactobacillus casei pode melhorar a função de barreira intestinal.
A tecnologia de sequenciamento metagenômico pode determinar a espécie e a porcentagem de microrganismos em uma amostra, enquanto a PCR quantitativa de fluorescência em tempo real é mais econômica e pode determinar a quantidade específica de uma determinada bactéria na amostra. O defeito da PCR quantitativa de fluorescência em tempo real é que ela só pode detectar um número limitado de bactérias. No futuro, será utilizado estudo metagenômico de probióticos para novas pesquisas. PCR quantitativo fluorescente em tempo real foi usado para analisar quantitativamente seis espécies da microbiota intestinal, incluindo E.coli, Enterococcus, Bifidobacterium, Bacteroides, Lactobacillus e Clostridium tenella.
Duração da pesquisa foi maior que estudos anteriores
Em vários outros estudos, os autores sugeriram que a microbiota intestinal estava geralmente em um estado de equilíbrio simbiótico, mas a ingestão excessiva de álcool em longo prazo levaria ao desequilíbrio da flora intestinal, o que foi consistente com os achados do presente estudo. Além disso, o estudo também descobriu que, após a suplementação do probiótico, houve um aumento significativo na quantidade de Lactobacillus e Bifidobacterium. Esses resultados indicaram que a suplementação do Lactobacillus casei pode regular distúrbios da microbiota intestinal em pacientes com lesão hepática alcoólica, o que pode ser um dos mecanismos de melhora do metabolismo lipídico.
Neste estudo, 57 de 158 pacientes com lesão hepática alcoólica apresentavam risco nutricional pelo NRS2002. Os motivos para o risco nutricional podem envolver o fato de que pacientes com comprometimento da função hepática apresentavam disfunção digestiva e de absorção, o que ocasionava desequilíbrio de nutrientes e metabolismo energético. Os sintomas gastrointestinais de pacientes com lesão hepática alcoólica são mais evidentes, o que afeta o apetite, e a desnutrição era comum nos pacientes com DHA. Beber excessivamente por longo prazo pode causar desequilíbrio da microbiota intestinal e danos à mucosa intestinal, fazendo com que a função de absorção de nutrientes seja enfraquecida, o que causaria ou agravaria os danos ao fígado. Os probióticos foram usados como intervenção neste estudo. Além disso, foi dado conselho geral de nutrição e estilo de vida para os pacientes: manter abstinência de álcool, boa alimentação, hábitos de exercício e peso adequado, fatores muito importantes para a recuperação de pacientes com DHA.
Este estudo tem vários pontos fortes. Em primeiro lugar, o tamanho da amostra forneceu relativamente mais poder para examinar o efeito do Lactobacillus casei no metabolismo lipídico e na microbiota intestinal em pacientes com lesão hepática alcoólica. Em segundo lugar, a duração da pesquisa foi maior do que a maioria dos estudos anteriores em pacientes com lesão hepática alcoólica. A limitação deste estudo foi que 60 dias de intervenção ainda eram muito curtos para examinar o efeito do Lactobacillus casei no metabolismo lipídico e na microbiota intestinal em pacientes com complicações de lesão hepática alcoólica, e não foi observada correlação significativa entre função hepática, perfil lipídico e microbiota intestinal. Além disso, foi recomendado aos pacientes manterem sua dieta diária e atividade física, mas não foi monitorado seu estilo de vida durante o período de intervenção – embora obtidos acordos verbais dos pacientes de que não alterariam sua dieta ou estilo de vida durante o período de intervenção.
Terceiro, o tamanho da amostra tem um poder estatístico limitado para encontrar diferenças significativas em outros indicadores, portanto, pesquisas em larga escala são necessárias para confirmar esses achados. Quarto, este ensaio clínico randomizado foi um estudo de centro único devido às limitações de orçamento, portanto, pode não ser generalizável para pacientes com lesão hepática alcoólica em geral. Em resumo, houve distúrbio do metabolismo lipídico e desequilíbrio da microbiota intestinal em pacientes com lesão hepática alcoólica, mas a suplementação de Lactobacillus casei pode melhorar o metabolismo lipídico e regular os distúrbios da microbiota intestinal em pacientes com lesão hepática alcoólica. O estudo ‘Effect of Lactobacillus casei on lipid metabolism and intestinal microflora in patients with alcoholic liver injury’ foi publicado no European Journal of Clinical Nutrition – https://doi.org/10.1038/s41430-020-00852-8.