LcS beneficia crianças com excesso de peso
Pesquisadores de duas universidades japonesas avaliaram os efeitos da cepa probiótica com resultados positivos
A obesidade infantil pode levar a doenças do estilo de vida como hipertensão, diabetes, hiperlipidemia, gota, distúrbios cerebrovasculares, arteriosclerose e doença cardíaca isquêmica na idade adulta, e deve ser controlada ainda na infância para garantir uma vida adulta saudável. Atualmente, é aceito que a microbiota intestinal desempenha um papel na fisiopatologia da obesidade como um importante fator ambiental para geração de energia e regulação da inflamação. Estudos recentes em animais indicaram que a proporção de Bacteroidetes foi 50% menor em ratos magros em relação a camundongos geneticamente obesos, com um aumento inverso na proporção de Firmicutes. Achados semelhantes foram relatados em humanos, pois estudos observaram um declínio na proporção de Firmicutes e aumento na proporção de Bacteroidetes na microbiota intestinal de adultos obesos submetidos a tratamento com dieta restrita em carboidratos e gorduras. No entanto, todos esses estudos sobre a relação entre a obesidade e a microbiota intestinal foram realizados em adultos, com uma pequena quantidade de dados incertos disponíveis para crianças. Como as bifidobactérias são mais dominantes do que os Bacteroidetes na microbiota intestinal de crianças e com relatos em modelos animais citando o efeito das bifidobactérias na supressão da endotoxemia e, consequentemente, na prevenção do diabetes tipo 1 – ao mesmo tempo em que melhora a hipercolesterolemia – foi proposto que a proliferação de bifidobactérias no intestino de crianças poderia melhorar tais complicações.
Para comprovar a proposta acima, levantou-se a hipótese de que a proliferação de bifidobactéria no intestino de crianças poderia melhorar a obesidade e as complicações associadas. Primeiro, foi comparada a microbiota intestinal basal entre crianças obesas e não obesas, e os resultados mostraram que as proporções de bifidobactéria em crianças obesas foram menores do que em crianças não obesas. Em seguida, dado que é improvável que a administração externa da bifidobactéria atinja o intestino grosso viva, foi solicitada a ingestão de uma bebida contendo Lactobacillus casei Shirota (LcS) – que é o único probiótico comprovado que aumenta a quantidade de bifidobactérias no intestino – para as crianças obesas. Depois, foram examinados quaisquer efeitos potenciais dessa bebida na perda de peso, hiperlipidemia e redução de açúcar no sangue como desfecho primário, e melhora da disbiose intestinal e do ambiente microbiano como desfechos secundários.
Foram realizados dois estudos prospectivos: 1) estudo comparativo da microbiota intestinal entre crianças obesas e não obesas; 2) investigação dos efeitos do consumo da bebida contendo LcS na melhora da obesidade, hiperlipidemia e tolerância à glicose. Os participantes foram crianças obesas com índice de massa corporal (IMC) escala Z igual ou superior a 2,0 e crianças saudáveis não obesas que consultaram o Ambulatório de Pediatria do Hospital Universitário afiliado da Universidade Juntendo, no Japão, de 1 de abril de 2012 a 31 de março de 2013. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Estudos Humanos da Universidade Juntendo. De acordo com a versão revisada da Declaração de Helsinque (revisão final: outubro de 2000, com notas no rodapé adicionadas em 2002 e 2004), os participantes foram satisfatoriamente informados sobre o conteúdo e os métodos da pesquisa, e o consentimento informado foi obtido por escrito. Este projeto de pesquisa foi realizado após ser registrado no Registro de Ensaios Clínicos da UMIN (número: UMIN00000698).
O produto teste foi o leite fermentado contendo LcS (YIT 9029) (Yakult 400, Yakult Honsha Co., Ltd., Tóquio, Japão), composto de leite desnatado, xarope e aromatizante. A composição de cada frasco de 80 ml era de energia: 62 kcal; proteínas: 1,0 g; lipídeos: 0,1 g; carboidratos: 14,4 g; e sódio: 15 mg. O número de LcS era ≥4×1010 no momento da ingestão. As duas investigações foram realizadas por meio de 1) Análise de amostras de fezes de todos os indivíduos no exame médico inicial – a microbiota intestinal e a concentração de ácidos graxos nas fezes dos participantes de ambos os grupos no exame médico inicial foram avaliadas pelo método descrito a seguir, que foi realizado após um exame comparativo entre os dois grupos. 2) Investigação do efeito do probiótico no grupo obeso – o grupo obeso foi submetido apenas à terapia de dieta e exercícios nos primeiros seis meses do período de observação e, em seguida, consumiu um frasco da bebida contendo LcS diariamente durante os últimos seis meses. O peso corporal, os níveis de triglicerídeos no sangue periférico e no soro, o nível de colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL) e o nível de glicemia em jejum antes da ingestão do produto teste foram avaliados três e seis meses após o início da ingestão da bebida.
A meta de energia total foi calculada por um método simples ([idade×100]+1.000 kcal), e a proporção de calorias foi controlada em uma proporção de carboidratos:proteína:gordura de 50-55%:15-20%:30%. Os participantes foram instruídos a realizar exercícios que consumissem aproximadamente 10% de sua ingestão calórica diária total, pelo menos uma vez em dias alternados. Os participantes e seus pais foram orientados sobre a dieta e os exercícios, e instruídos a manterem um diário de gerenciamento para confirmar que conduziram apropriadamente, conforme o protocolo do estudo. O desfecho primário foram os efeitos potenciais da bebida na perda de peso, hiperlipidemia e redução da glicemia. O peso corporal dos participantes e os resultados dos marcadores bioquímicos foram registrados em um prontuário médico na clínica durante o período do estudo.
Para a análise estatística dos itens do prontuário foram considerados os achados gerais anteriores ao início da ingestão da bebida teste e os três e seis meses após o início da ingestão. Amostras de sangue em jejum (3 ml) foram obtidas e as análises bioquímicas feitas usando métodos padrão da clínica. Os valores de triglicerídeos, colesterol HDL e glicemia em jejum foram registrados e avaliados de acordo com a definição de síndrome metabólica em pacientes pediátricos. O desfecho secundário foi a melhora da disbiose intestinal e do ambiente microbiano. A microbiota intestinal e as concentrações de ácidos graxos nas fezes foram analisadas antes da ingestão do produto teste (no início e seis meses após dieta e terapia de exercícios apenas) e seis meses após o início de tal ingestão.
Análise Estatística
A análise livre de distribuição t de Student (peso corporal, nível de triglicerídeos, colesterol HDL, glicemia e pH das fezes) e um teste de classificação sinalizada de pares pareados de Wilcoxon livre de distribuição (microbiota intestinal e concentração de ácido orgânico nas fezes) foram usados para comparar os resultados da análise entre os dois grupos. Um teste t pareado paramétrico foi usado para comparar os valores antes e depois do consumo (peso corporal, triglicerídeos, colesterol HDL, glicemia e pH nas fezes) juntamente com um teste não paramétrico de postos sinalizados de Wilcoxon (microbiota intestinal e concentração de ácido orgânico nas fezes). O SPSS Ver. 11 software (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para a análise, com nível de significância estabelecido em 5% em ambos os testes.
Análise da microbiota fecal
Amostras de fezes recém-excretadas foram coletadas dos participantes antes de consumir produto teste na linha basal e após seis meses de consumo. Na clínica, aproximadamente 0,5 g de fezes foi coletada e colocada em um tubo contendo 2 ml de RNAlater (Ambion Inc., Austin, TX, EUA) e um tubo vazio (para análise de ácidos orgânicos). Após incubação em temperatura ambiente por 10 min a fim de permitir a penetração suficiente de RNAlater nos microrganismos, as amostras fecais foram resfriadas a -20°C e, depois, enviadas para o Instituto Central Yakult onde a contagem bacteriana foi determinada por RT-PCR. A análise quantitativa de RT-PCR foi realizada pelos métodos de Matsuda et al. (2007, 2009). A especificidade dos ensaios quantitativos de RT-PCR usou iniciadores específicos de gênero-, espécie-, Staphylococcus spa- e Staphylococcus.
Concentração fecal de ácidos orgânicos e pH
Uma porção de fezes homogeneizada foi pesada, misturada com ácido perclórico 0,15 M em um volume de 4 vezes e incubada a 48°C por 12h. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 20.000× g por 10 min a 48°C e o sobrenadante filtrado com um filtro de membrana de 0,45 μm (Millipore Japan, Tóquio, Japão) e esterilizado no Instituto Central Yakult. As concentrações de ácidos orgânicos nesta amostra foram medidas usando o sistema Waters HPLC (Waters 432 Conductive Detector, Waters Corporation, Milford, MA, EUA) e a coluna Shodex Rspack KC-811 (Showa Denko, Tóquio, Japão). O pH fecal foi medido diretamente nas fezes homogeneizadas usando um pHmetro D-51 com um eletrodo de vidro (Horiba Seisakusho Co., Ltd., Tóquio, Japão).
Resultados mostram efeitos do probióticos
No Ambulatório de Pediatria, afiliado da Universidade, crianças obesas (n=12; idade média = 10 anos e nove meses; proporção masculino/feminino = 8:4; IMC escala Z = 2,7±1,7) e crianças saudáveis não obesas (n=22; idade média = oito anos e seis meses; proporção masculino/feminino = 13:9; IMC escala Z = 0,1±0,7) foram registradas no estudo. Na análise da microbiota intestinal no exame médico inicial, o número de bifidobactérias nas fezes do grupo obeso foi significativamente menor em relação ao grupo não obeso (grupo obeso, 7,9±1,5 vs grupo não obeso, 9,8±0,5 Log10células/g; P<0,01), juntamente com um declínio significativo no número total de bactérias: o grupo Bacteroides fragilis e o grupo Atopobium, e o subgrupo Lactobacillus gasseri. As Enterobacteriaceae fecais não foram notadamente dominantes no grupo obeso em comparação com o grupo não obeso. No entanto, a proporção entre o número de Enterobacteriaceae fecais e bactérias fecais totais tendeu a ser maior no grupo obeso (grupo obeso, 0,73±0,1 vs grupo não obeso, 0,68±0,1; P<0,1). Na análise da concentração de ácido orgânico nas fezes, os níveis de ácido acético foram menores no grupo obeso do que no grupo não obeso (grupo obeso, 45,1±16,9 vs grupo não obeso, 57,9±17,6 μmol/g; P<0,05).
O grupo obeso foi submetido a terapia de dieta e exercícios nos primeiros seis meses do período de observação e, em seguida, consumiu um frasco de uma bebida contendo LcS (40 bilhões de LcS por frasco) diariamente, durante os últimos seis meses. Foi confirmado que os participantes tiveram grande sucesso com sua dieta e terapia de exercícios e consumiram estritamente o produto teste todos os dias, com base em uma análise do diário de gerenciamento e entrevista na clínica. O peso corporal, os níveis de triglicerídeos no sangue periférico e no soro, o nível de colesterol HDL e a glicemia em jejum foram monitorados. Os resultados mostraram que o peso corporal médio no grupo obeso seis meses após o início da ingestão da bebida contendo LcS foi significativamente menor do que na linha basal (-2,9±4,6%; P<0,05), embora a terapia de dieta e exercícios sozinhos não tenham contribuído para a redução do peso corporal. Além disso, o nível de colesterol HDL foi significativamente maior seis meses após o início da ingestão da bebida em relação à linha basal (+11,1±17,6%; P<0,05).
Uma tendência de declínio também foi observada nos níveis de triglicerídeos e glicose no sangue seis meses após o início da ingestão da bebida em comparação com os níveis basais, entretanto, a diferença não foi significativa (-6,0±13,9% e -3,0±8,1%, respectivamente). Na análise da microbiota intestinal foi observado um aumento significativo no número de bifidobactérias seis meses após o início da ingestão da bebida em comparação com os valores basais (7,0±1,2 antes da ingestão após seis meses de dieta e exercícios isolados vs 9,1±1,2 Log10células/g após ingestão; P<0,01). O número de subgrupos do L. casei também aumentou significativamente seis meses após o início da ingestão da bebida em comparação com os valores basais.
Em relação ao número de grupo B. fragilis, Atopobium e subgrupo L. gasseri nas fezes não foram observadas diferenças significativas entre antes e depois do consumo da bebida contendo LcS. Embora não tenha sido observada redução estatisticamente significativa no número absoluto de Enterobacteriaceae fecais depois que os participantes iniciaram a ingestão da bebida, a proporção do número de Enterobacteriaceae fecais das bactérias fecais totais mostrou uma tendência decrescente após o início da ingestão da bebida em comparação com os valores basais (0,73 ± 0,1 antes da ingestão e após seis meses de dieta e exercícios apenas vs 0,68 ± 0,2 após a ingestão; P<0,1). Na análise das concentrações de ácido orgânico nas fezes, a concentração de ácido acético foi maior após o início da ingestão da bebida do que antes (42,0 ± 15,5 antes da ingestão e após seis meses de dieta e terapia apenas com exercícios vs 66,8 ± 4,96 μmol /g após ingestão; P<0,01). O pH fecal mostrou uma tendência decrescente após o início da ingestão da bebida em comparação com os valores basais. Não houve diferenças significativas em nenhum dos marcadores sorológicos ou componentes fecais entre pré e pós-dieta + exercícios.
Dificuldades para tratar a obesidade na infância
O grande problema no tratamento de pacientes obesos é que, mesmo que haja melhora com dieta e exercícios, o efeito acaba sendo temporário devido aos rebotes subsequentes, que também foram observados no presente estudo. A falta de exercícios/mudanças suficientes na dieta pode ter impedido a observação de uma perda de peso substancial. No entanto, se a microbiota intestinal constituída principalmente de bifidobactérias puder ser mantida pela ingestão regular de leite fermentado com LcS, estabilizando assim o ambiente intestinal, a reversão à obesidade pode ser evitada mesmo após exercícios estressantes e terapia dietética. Além disso, essa terapia pode ser capaz de prevenir o desenvolvimento futuro de doenças do estilo de vida, tornando os achados do presente estudo notáveis. A interação entre o metabolismo lipídico ou da glicose e a microbiota intestinal tem sido gradualmente elucidada. Os triglicerídeos no sangue são decompostos em ácidos graxos livres e glicerol pela lipoproteína lipase, com ácidos graxos livres posteriormente incorporados nas células. Fator adiposo induzido pelo jejum (FAIPJ) inibe a lipoproteína lipase dentro do epitélio intestinal suprimindo, assim, a proliferação excessiva de adipócitos.
Algumas bactérias intestinais podem suprimir a atividade do FAIPJ, e a proliferação dessas bactérias acelera o acúmulo de triglicerídeos, promovendo a obesidade por meio da inibição da oxidação de ácidos graxos nos músculos esqueléticos. Além disso, os lipopolissacarídeos, que são componentes das paredes celulares dessas bactérias, têm sido compreendidos como causa de inflamação crônica, levando a doenças do estilo de vida como as anormalidades na tolerância à glicose. A obesidade induzida por microrganismos também demonstrou mediar o sistema imunológico inato. Níveis aumentados de ácidos graxos livres podem induzir a sinalização do receptor Toll-like 4 em adipócitos e macrófagos, levando à inflamação metabólica em indivíduos obesos. Acredita-se que os ácidos graxos de cadeia curta produzidos pelos probióticos contribuam para a redistribuição do colesterol do plasma para o fígado, o que pode explicar o aumento dos níveis séricos de colesterol HDL com a administração de probióticos. No entanto, não há evidências de que o colesterol HDL responda mais sensivelmente à terapia probiótica. A não observação de uma diferença significativa no nível sérico de triglicerídeos, mesmo seis meses após o consumo de uma bebida contendo LcS, pode ser devido ao pequeno tamanho da amostra no presente estudo.
Espera-se que as bifidobactérias promovam a fermentação intestinal e a redução da ingestão de alimentos, massa gorda e esteatose hepática. As bifidobactérias também são conhecidas por reduzirem a permeabilidade intestinal e aliviarem a endotoxemia. Além disso, diz-se que as bifidobactérias promovem a secreção de insulina induzida pela glicose, ajudando a reduzir o ganho de peso corporal e a produção de mediadores inflamatórios. Consistente com os achados de estudos anteriores, o presente estudo mostrou que o número de bifidobactérias fecais aumentou após o consumo de leite fermentado com LcS. O ácido acético, que é o principal produto metabólico das bifidobactérias, tem uma forte ação bactericida contra Enterobacteriaceae e Staphylococcus in vitro.
Além disso, entre os pacientes no período intraoperatório, uma única administração de LcS ou a administração combinada com Bifidobacterium breve Yakult ou prebióticos (simbióticos) causou um aumento no número de bifidobactérias intestinais endógenas, suprimiu a proliferação de bactérias intestinais destrutivas e melhorou o ambiente entérico. Esses achados anteriores sugerem que a melhora no ambiente entérico, tais como o aumento da concentração de ácido acético e/ou diminuição do pH que acompanham o aumento do número de bifidobactérias intestinais devido ao consumo de leite fermentado com LcS, são importantes para inibir a proliferação intestinal de bactérias nocivas. A carga bacteriana total foi significativamente menor nas crianças obesas do que nas crianças controle, e diferenças semelhantes foram observadas nos resultados antes e após a ingestão do produto teste. O número reduzido de bactérias totais pode refletir uma redução no número de anaeróbios em geral, no entanto, houve uma diminuição estatisticamente significativa no número de bifidobactéria. Portanto, necessita-se demonstrar a reprodutibilidade desses achados em estudos futuros.
Discussão indica motivos da eficácia dos microrganismos
Uma razão para a eficácia do Lactobacillus casei Shirota contra a obesidade pode ser que o ácido acético produzido pelas bifidobactérias intestinais endógenas, cuja proliferação é estimulada pelo LcS, suprime a proliferação de grupos de bactérias que causam obesidade. Em outro estudo realizado por este grupo, crianças não obesas apresentaram números significativamente reduzidos de Enterobacteriaceae fecais e números significativamente aumentados de bifidobactéria e lactobacilos totais após consumirem o leite fermentado contendo LcS.
Bifidobactérias proliferadas pelo lactobacilo probiótico podem ter efeito homeostático, promovendo ganho de peso em hospedeiros desnutridos, pois as crianças daquela revisão sofriam de doenças graves subjacentes. O mecanismo pelo qual o LcS estimula a proliferação de bifidobactérias ainda não foi esclarecido, entretanto, como as bifidobactérias são bactérias intestinais vulneráveis aos ácidos gástrico e biliar, e muito difíceis de usar como probióticos, o consumo de leite fermentado contendo LcS pode representar uma nova estratégia para o tratamento da obesidade.
Por outro lado, o tamanho da amostra foi pequeno, portanto, não foi possível observar uma diferença significativa nos níveis de triglicerídeos no sangue e de glicemia em crianças obesas, mesmo quando foi feita uma comparação entre o período de ingestão de leite fermentado com LcS e o período sem ingestão. Além disso, durante a ingestão de leite fermentado com LcS as crianças obesas foram submetidas a exercícios e dietas por um período maior do que o período sem consumo, e sua composição corporal pode ter mudado com as flutuações sazonais. Essas questões podem ter tido um grande efeito sobre os resultados do presente estudo. Para resolver esses problemas, é necessário aumentar o tamanho da amostra e classificar as crianças obesas em grupo exercício e dieta e grupo dieta + leite fermentado com LcS, e realizar um acompanhamento pelo mesmo período.
Conclusões
Reduções significativas nas concentrações fecais de bifidobactérias e ácido acético foram observadas em crianças obesas. O Lactobacillus casei Shirota contribuiu para a perda de peso, ao mesmo tempo em que melhorou o metabolismo lipídico em crianças obesas por meio de um aumento significativo nos números de bifidobactérias e na concentração de ácido acético. O artigo ‘The effects of the Lactobacillus casei strain on obesity in children: a pilot study’ foi publicado no periódico Beneficial Microbes, 2017; 8(4): 535-543.