Lactobacillus casei Shirota inibe Helicobacter pylori
Estudo desenvolvido por pesquisadores gregos foi publicado na Applied and Environmental Microbiology
*Yasumi Ozawa Kimura
Bactéria que vive no muco que cobre a superfície do estômago, a Helicobacter pylori foi identificada pela primeira vez em 1899 pelo pesquisador Walery Jaworski, da Universidade Jaguelônica, em Cracóvia (Polônia), quando investigava segmentos de lavagem gástrica de um humano. Redescoberta em 1979 pelo patologista australiano Robin Warren que, em 1981, se uniu a Barry Marshall para dar continuidade às pesquisas, a bactéria foi finalmente identificada como causadora de gastrites e úlceras, o que deu aos dois cientistas o Prêmio Nobel de Medicina em 2005. A Helicobacter pylori é uma bactéria patogênica espiral gram-negativa anaeróbica facultativa que infecta o estômago de 50% da população mundial e, além de ser a principal causadora de gastrites e úlceras pépticas, tem sido relacionada com o desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico e linfoma da mucosa associada ao tecido. Para encontrar caminhos que possam evitar os prejuízos causados pela bactéria, recentemente as atenções de muitos cientistas estão voltadas às interações da Helicobacter pylori com lactobacilos probióticos.
Entre os relatos, há descrição de que houve inibição do crescimento de H. pylori em camundongos gnotobióticos BALB/c alimentados com rações contendo Lactobacillus salivarius, e os títulos dos anticorpos específicos de H. pylori apresentaram queda, enquanto que os animais não-alimentados com lactobacilos apresentaram intensas colonizações de H. pylori e causaram ativas gastrites. Em outro estudo, a administração oral de sobrenadantes de culturas de L. acidophilus resultaram na inibição de H. felis em modelos animais. Sobrenadantes de culturas de L. acidophilus foram eficientes ‘in vitro’ e apresentaram um efeito parcial de longo prazo sobre a H. pylori em humanos.
A atividade anti-H. pylori foi avaliada através de métodos indiretos, tais como a UBT, ao invés da quantificação das culturas de H. pylori e a avaliação histopatológica. Conseqüentemente, conclusões definitivas podem ser obtidas sobre a eficiência dos probióticos sobre as pessoas infectadas com H. pylori, e essa questão certamente necessitará de estudos mais detalhados, baseados em pesquisas com modelos animais, em relação à forma como os probióticos são administrados, a dose administrada, o modo e a duração do período da administração.
Os pesquisadores D. Sgouras, B. Martinez-Gonzalez, E. Eriotou e A. Mentis, do Laboratório de Microbiologia Médica, Instituto Pasteur Helênico; P. Maragkoudakis, G. Kalantzopoulos e E. Tsakalidou, do Laboratório de Pesquisas em Laticínios, Faculdade de Agronomia de Atenas; K. Petraki, do Laboratório de Patologia, Hospital Hipocrateano; e S. Michopoulos, da Clínica de Gastroenterologia, Hospital Alexandria, em Atenas, na Grécia, estudaram o potencial inibitório dos L. casei Shirota (LCS) isolados a partir do leite fermentado Yakult sobre a H. pylori utilizando métodos de inibição ‘in vitro’ usando a variedade H. pylori SS1 (variedade Sidney) e nove isolados clínicos da bactéria. Os estudos ‘in vivo’ foram conduzidos com animais infectados com H. pylori SS1 em um período de nove meses. A atividade ‘in vitro’ contra a H. pylori SS1 e todos os isolados clínicos foram observados na presença de células viáveis de L. casei Shirota, mas não em sobrenadantes de culturas sem LCS, embora ocorra uma profunda inibição da atividade da urease.
Os estudos ‘in vivo’ foram realizados em um período de nove meses com a administração de L. casei Shirota misturado ao suprimento de água em camundongos C57BL/6 de seis semanas infectados previamente com H. pylori SS1 (grupo estudo n = 25). O grupo controle de animais infectados com H. pylori – sem L. casei Shirota (n = 25) e o grupo não-infectado com L. casei Shirota (n = 25) também foram avaliados. A colonização do H. pylori e o desenvolvimento da gastrite foram analisados a 1, 2, 3, 6 e 9 meses após a infecção.
Observou-se uma significativa redução dos níveis de colônias de H. pylori no antro e na mucosa nos animais tratados com L. casei Shirota, bem como nas culturas viáveis, comparados com os níveis do grupo infectado com H. pylori sem L. casei Shirota. Essa redução foi acompanhada por uma significativa diminuição na inflamação da mucosa observada em todos os períodos do experimento. Houve uma tendência na diminuição dos níveis de imunoglobulina G no soro dos animais tratados com os lactobacilos, mas essa queda não foi significativa em nível estatístico.
Discussão
A inibição da H. pylori SS1 e das nove espécies clínicas selvagens ficaram evidenciadas com a determinação em ágar somente quando houve um envolvimento direto dos L. casei Shirota. Não houve atividade inibitória em culturas sem os L. casei Shirota, tanto em pH 4,5 ou a 6,5. Os resultados obtidos foram coincidentes com as recentes observações de que os sobrenadantes de culturas isoladas de LCS obtidos através da centrifugação, contendo no mínimo 104 UFC (unidades formadoras de colônia) de lactobacilos vivos/ml, permaneceram ativos ‘in vitro’ contra H. pylori e que, após a esterilização em filtro de porosidade 0,22 mµ, foi retirada a atividade inibitória. Nas experiências com culturas líquidas de H. pylori, a adição de sobrenadantes de culturas isoladas de LCS (pH 4,5) e respectivos meios de cultura controles (pH 4,5) diminuíram o pH final após a incubação, resultando na inibição da atividade da urease e a viabilidade da H. pylori. Está bem documentado que a viabilidade da H. pylori ‘in vitro’ é muito baixa sob estresse ácido na falta da uréia. A diminuição do pH através da produção do ácido lático pelos L. casei Shirota tem sido apontada como outro fator para causar a inibição das H. pylori ‘in vitro’. Mais especificamente, em culturas conjuntas de H. pylori e L. salivarius, concentrações acima de 10 mM produzidas pelos lactobacilos inibiram fortemente a atividade da urease e a viabilidade das H. pylori. Quando se incubou a H. pylori em concentrações de 100 a 1 mM, observou-se que houve uma inibição da urease acima de 70% para 15 mM de ácido lático em três horas de incubação.
As determinações em culturas líquidas nos quais somente 10% dos sobrenadantes de culturas isoladas de L. casei Shirota estavam presentes, a quantidade de ácido lático determinada através de HPLC (cromatografia líquida de alta performance) foi de 15 mM, induzindo a inibição da atividade de urease das H. pylori e a sua viabilidade. Além disso, quando os sobrenadantes das culturas de L. casei Shirota ajustados a pH 6,5 foram utilizados houve uma significativa inibição da atividade da urease da H. pylori, embora não ocorresse redução na contagem das células viáveis em 24 horas, possivelmente devido à falta do estresse ácido sobre a H. pylori. No conjunto, esses resultados sugerem que o ácido lático produzido pelo L. casei Shirota interferiu na inibição do sistema de urease da bactéria. Essa atividade do ácido lático está baseada na combinação do efeito inibitório sobre o sistema de urease e à baixa capacidade de sobrevivência da H. pylori em baixo pH na falta de uréia.
No experimento, a inibição da urease pelo ácido lático presente no sobrenadante de culturas de L. casei Shirota pôde comprovar a incapacidade da H. pylori em se desenvolver em condições de baixo pH. No respectivo controle de meio MRS (pH 4,5) acidificado com HCl, no qual o sistema urease funciona, pequenas concentrações de uréia endógena puderam sustentar a sobrevivência das H. pylori nas primeiras horas, mas não resistiu à incubação ao período de 24 horas. O mecanismo exato pelo qual os lactobacilos inibem a atividade da urease permanece indefinido. Entretanto, outros observaram pouco ou nenhum efeito sobre a atividade da urease atribuído ao ácido lático, embora comparações diretas com as pesquisas desses autores são impossíveis devido aos diferentes delineamentos experimentais usados para a determinação do ácido lático.
Os pesquisadores estudaram detalhadamente, por meio da técnica do HPLC, a cinética da produção do ácido lático em culturas de L. casei Shirota que se desenvolveram em meio de cultura MRS e consideraram o ácido lático o principal produto do seu metabolismo (a concentrações acima de 150 mM). Além disso, somente traços de gorduras estiveram presentes em níveis de 0,1%, atribuídos à adição do detergente Tween ao meio de cultura MRS, e os Lactobacillus casei apresentaram baixa atividade proteolítica comparados com outros lactobacilos, como os L. bulgaricus. Finalmente, a competição por nutrientes pode ter sido determinante, como os pesquisadores não observaram inibição da Helicobacter pylori quando usaram o E. coli como controle positivo para a diminuição de nutrientes nas culturas.
Os pesquisadores isolaram os Lactobacillus casei Shirota nas amostras de fezes dos animais em teste através da utilização de meios de cultura seletivos, bem como através de técnicas de PCR. Para o grupo de animais com H. pylori e L. casei Shirota foi observada uma significativa redução da colônia de H. pylori na mucosa gástrica em todo o período de observação (nove meses). Na experiência, colônias na faixa de 104 UFC/g foram detectadas com dificuldade através da avaliação histopatológica. Os pesquisadores basearam as suas conclusões através dos dados de colonização da H. pylori de amostras dissecadas do estômago dos animais, além da avaliação histopatológica.
Ação em humanos
Em pesquisa recente na qual houve atuação dos L. casei Shirota sobre a colônia de H. pylori em voluntários positivos que ingeriram o leite fermentado contendo os probióticos L. casei Shirota foi observado um discreto resultado positivo. Sob o ponto de vista da inibição da urease pelo ácido lático, métodos mais precisos do que o UBT (determinações das células viáveis ou avaliação histopatológica) deverão ser utilizados na avaliação da colonização da H. pylori em estudos clínicos relacionados às bactérias láticas com potencial de inibir a atividade da urease.
Neste estudo foi observada uma significativa atenuação da inflamação crônica e aguda da mucosa gástrica, com nenhuma ou discreta infiltração linfoplasmacítica na lâmina própria, que pode ser atribuída à diminuição das colônias de H. pylori nos animais tratados com L. casei Shirota. Entretanto, a relação entre o mecanismo sistêmico com um possível respaldo imunológico não pôde ser esclarecida. Estudos dos efeitos imunológicos da administração oral dos L. casei Shirota aumentam a possibilidade de modulação das respostas imunológicas no estabelecimento da imunidade tumoral e na indução da atividade antitumoral específica. Os L. casei Shirota promovem a produção de diversas citoquinas envolvidas na regulação das respostas imunes das células do hospedeiro, resultando na alteração da susceptibilidade linfocítica para a apoptose.
Os L. casei Shirota são capazes de aumentar significativamente a imunidade celular, demonstrada pelo retardamento da resposta de hipersensibilidade ao L. monocytogenes inativado termicamente, e aumentar a resposta do hospedeiro contra a infecção oral por L. monocytogenes em camundongos. Assim, o estímulo da imunidade específica e não-específica poderia ser diferente no caso da atividade anti-H. pylori, que deverá ser investigada posteriormente pelos autores dessa pesquisa. A redução da gastrite associada à H. pylori se refletiu na diminuição da resposta da IgG anti-H. pylori nos nove meses de realização do experimento.
A capacidade dos LCS inibirem o desenvolvimento das colônias de H. pylori e a supressão da inflamação ficaram bastante evidentes nos animais tratados com os probióticos. Este foi o primeiro relato científico de que a administração dos L. casei Shirota promoveram a inibição das colônias de H. pylori e a significativa diminuição da gastrite em modelos animais infectados com a bactéria. Os pesquisadores acreditam que o método da administração contínua dos probióticos através do suprimento de água aos animais, em combinação com as altas concentrações, teve grande influência nos resultados positivos.
*Yasumi Ozawa Kimura é farmacêutica-bioquímica
e gerente de P&D da Yakult no Brasil