LcS ajuda a controlar carcinogênese

Polissacarídeo isolado da parede celular do LcS suprime fortemente a produção de IL-6 e reduz o risco carcinogênico

Harumi Mizukoshi, Kazumasa Kimura, Haruo Ikemura, Yoko Mori, Masato Nagaoka Yakult Central Institute for Microbiological Research, Kunitachi-shi, Tokyo, Japan

Bebidas probióticas contendo LcS

O Lacticaseibacillus paracasei Shirota YIT 9029 (LcS – anteriormente Lactobacillus casei Shirota YIT 9029) é uma bactéria do ácido lático descoberta pelo médico e pesquisador Minoru Shirota em 1930. As bebidas probióticas contendo LcS têm sido amplamente consumidas no Japão há mais de 80 anos e a cepa tem várias atividades fisiológicas, incluindo capacidades imunomoduladoras. O LcS melhora a função imunológica do hospedeiro e reduz o risco de doenças, incluindo doenças infecciosas e câncer. Para enfermidades causadas por respostas imunes anormais (alergias, doenças inflamatórias intestinais, doenças autoimunes), os polissacarídeos na parede celular do LcS suprimem reações inflamatórias excessivas. Utilizando células mononucleares da lâmina própria (LPMCs) e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), Matsumoto e colaboradores descobriram que, quando ligado a um complexo polissacarídeo peptidoglicano (PS-PG1), LCPS-1 – um polissacarídeo isolado da parede celular do LcS –, suprime fortemente a produção de interleucina 6 (IL-6), reduzindo assim o risco carcinogênico devido à inflamação crônica no intestino grosso.

Os polissacarídeos da parede celular estão distribuídos de forma desigual pela superfície celular nos lactobacilos e estão envolvidos em diversas funções fisiológicas. Os pesquisadores tentaram analisar a estrutura desses polissacarídeos e relatórios indicam que, mesmo dentro da mesma espécie (L. lactis, L. rhamnosus, L. helvético, L. casei e outros), os açúcares constituintes e suas propriedades de ligação, ramificação, substituição e outras propriedades podem variar. Portanto, existem diferenças significativas na estrutura dos polissacarídeos da parede celular, resultando em uma alta diversidade estrutural na composição dessa parede. Além disso, um estudo que utilizou microarranjos de lectinas para comparar cepas de Lactobacillus casei de diferentes fontes de isolamento descobriram que a cepa YIT 9029 se ligava apenas à CSL (lectina de ligação a Rha).

Ademais, uma variante sem o gene cps1C envolvido na síntese LCPS-1 (Δcps1C) no YIT9029, além da perda de LCPS-1, se liga a múltiplas lectinas além de CSL e, portanto, CSL se liga à LCPS-1 Rha. A parede celular do LcS são compostas por um peptidoglicano do tipo A4 e dois tipos de polissacarídeos neutros (LCPS-1 e LCPS-2). Destes, a estrutura do LCPS-2 foi determinada por Nagaoka e colaboradores. No entanto, LCPS-1 é uma molécula muito maior que LCPS-2, está presente em pequenas quantidades absolutas, difíceis de purificar, e possui uma estrutura complicada. Por essas razões, a sua estrutura ainda não foi determinada. Nossa hipótese é que a determinação da estrutura do LCPS-1 é importante para elucidar os mecanismos pelos quais afeta as respostas imunes do hospedeiro e, assim, objetivamos determinar sua estrutura primária.

A análise de LCPS-1 por cromatografia de exclusão de tamanho indicou que o polissacarídeo apresentou uma distribuição de peso molecular na faixa de 50-1500 kDa com uma média de 400-500 kDa. A análise dos espectros 1H NMR, 13C NMR e DOSY de LCPS-1 mostrou que era um polissacarídeo macromolecular e havia ~10 sinais cada para prótons anoméricos e carbonos, indicando que LCPS-1 pode ter uma estrutura repetitiva.  Além disso, quatro sinais de metila foram observados no espectro 1H NMR: dois sinais de metila do grupo acetil (N-acetil e O-acetil) e dois sinais de metila derivados de Rha. A análise do açúcar constituinte mostrou que LCPS-1 é composto de Glc, Rha, Gal e GlcN (ou GlcNAc) presentes em quantidades de 1700, 960, 470 e 330 nmol/mg, respectivamente, resultando em uma razão molar de ~10:6:3:2.

A análise de metilação de LCPS-1 mostrou a prevalência de sete tipos de acetatos de alditol parcialmente metilados (1,5-di-O-acetil-6-desoxi-2, 3,4-tri-O-metilmanitol, 1,5-di-O-acetil-2,3,4,6-tetra-O-metilhexitol, 1,3,5-tri-O-acetil-6-desoxi-2,4-di-O-metilmanitol, 1,4,5-tri-O-acetil-2,3,6-tri-O-metilhexitol, 1,2,5,6-tetra-O-acetil-3,4-di-O-metilhexitol, 1,3,4,5,6-penta-O-acetil-2-O-metilhexitol, 1,3,4,5,6-penta-O-acetil-2-N-metilacetamido-2-desoxihexitol). Foi identificada a presença de Rha1→, hexose1→, →3Rha1→, →4hexose1→, →2,6hexsose1→, →3,4,6hexose1→ e →3,4,6GlcNAc1→. No  entanto, foi difícil analisar diretamente a estrutura química do LCPS-1 porque a estrutura principal tem um peso molecular elevado e é presumivelmente complicada. Portanto, utilizamos decomposição limitada para obter fragmentos-chave de LCPS-1 com pequenos pesos moleculares utilizando diferentes condições conforme descrito abaixo. Esses fragmentos foram analisados posteriormente.

Estruturas de produtos de degradação controlada de ferreiro (Fr. S)

As reações controladas de degradação de Smith para LCPS-1 produziram fragmentos-chave (Fr. S) com pesos moleculares, indicando que eram provavelmente dissacarídeos

Degradação de Smith para LCPS-1

As reações controladas de degradação de Smith para LCPS-1 produziram fragmentos-chave (Fr. S) com pesos moleculares, indicando que eram provavelmente dissacarídeos. A análise por cromatografia gasosa (GC) mostrou que açúcares e álcoois de açúcar em Fr. S foram estimados como Glc, Rha, GlcN (GlcNAc), eritritol e glicerol, com proporção de composição de 1:3:2:3:4. A análise de metilação do Fr. S rendeu três tipos de álcoois de açúcar, 1,5-di-O-acetil-2,3,4,6-tetra-O-metilglucitol, 1,5-di-O-acetil-6-desoxi-2,3,4-tri-O-metilmanitol e 1,5-di-O-acetil-3,4,6-tri-O-metil2-N-metilacetamido-2-desoxiglucitol, na proporção de 1:3:2, respectivamente. Portanto, foi levantada a hipótese de que Glc1→ Rha1→ e GlcNAc1→ estavam presentes como porções terminais em uma proporção de 1:3:2.

Cada sinal no espectro ¹³C NMR possui um símbolo (A a AL) do lado do campo magnético baixo. Os três sinais anoméricos de prótons obtidos via ¹H NMR (δ4.787, 4.540 e 4.528) foram atribuídos a Rha (D, E), GlcNAc (C) e Glc (B), respectivamente, e a intensidade relativa integrada destes sinais com o próton anomérico de Glc definido para 1 foi 3:2:1. As constantes de acoplamento (J_HH) de GlcNAc (C) e Glc (B) foram 8,4 Hz e 8,0 Hz, respectivamente. Portanto, foi concluído que estes eram β-coordenados. Os dois sinais metil no lado de campo alto (δ2.052 e 1.321) foram atribuídos ao grupo acetil de GlcNAc e ao grupo metil da posição 6 de Rha (AK e AL, respectivamente), e sua força relativa integrada foi 6:9. A análise dos espectros DEPT 135 indicou a posição C6 (AG) de Glc e a posição C6 (AH) de GlcNAc. No entanto, os outros sinais do grupo metileno foram derivados de álcoois de açúcar (eritritol e glicerol) produzidos por degradação controlada de Smith. Portanto, cada açúcar obtido por uma degradação controlada de Smith foi ligado ao eritritol ou ao glicerol.

Os seguintes íons foram observados na análise de espectrometria de massa de tempo de voo quadrupolo de cromatografia líquida (LC-QToF-MS) (injeção de fluxo) de Fr. S: m/z 269.1240 [M+H]+, m/z 291.1101[M+Na]⁺, e m/z 286.1493 [M+NH4]⁺ que pode ser derivado de Rha-eritritol; m/z 296.1342 [M+H]⁺ e m/z 318.1214 [M+Na]⁺ que pode ser derivado de GlcNAc-glicerol; e m/z 277.0903 [M+Na]⁺ que pode ser derivado de Glc-glicerol. Os fragmentos de massa identificados estavam em boa concordância com a massa exata calculada. A partir destes resultados, foi concluído que o Fr. S era uma mistura de Rha-eritritol, GlcNAc-glicerol e Glc-glicerol em uma proporção de 3:2:1.

Estrutura de frações purificadas e desaminação

Os pesquisadores concentraram na presença de resíduos GlcNAc em LCPS-1 e tentaram a desaminação

Presença de resíduos GlcNAc em LCPS-1

Os pesquisadores concentraram na presença de resíduos GlcNAc em LCPS-1 e tentaram a desaminação para degradar especificamente a hexosamina. GlcNAc em LCPS-1 é substituído na posição 3; assim, primeiro foi realizado a desacetilação usando o método de Erbing e colaboradores e, posteriormente, a desaminação. A mistura de reação foi fracionada nos fragmentos chave Fr. 1, Fr. 2, e Fr. 3 com base no peso molecular, e os açúcares constituintes de cada fração foram analisados. Cada fração compreendia Glc, Gal, Rha e 2,5-anidromanitol (um produto de decomposição de GlcNAc). Foi ajustado o nível de 2,5 anidromanitol para 1 e calculamos a razão Glc:Gal:Rha para cada fração. Para o Fr. 3, a razão Glc:Gal:Rha foi de 3:1:2 e compreendia aproximadamente sete resíduos de açúcar. Da mesma forma, a proporção para Fr. 2 foi 7:2:4 e compreendia ~14 resíduos de açúcar; a proporção para Fr. 1 foi 27:7:14 e continha ~49 resíduos de açúcar. Além disso, foram comparados os espectros ¹H RMN, ¹³C NMR e HSQC para Fr. 1, Fr. 2, e Fr. 3. Espectros semelhantes foram observados para Fr. 1 e Fr. 2, e as estruturas básicas foram consideradas altamente semelhantes. Fr. 3 teve o menor peso molecular e foi considerado uma estrutura parcial de Fr. 1 e Fr. 2.

Estrutura do Fr. 1

Fr. 1 mostrou um espectro ¹H NMR semelhante ao Fr. 2. Contudo, na região anomérica, a proporção de αRha ligada ao 2,5-anidromanitol que constitui a cadeia linear foi de 1:1 em Fr. 2, enquanto 1:6 em Fr. 1. No Fr. 1, a proporção de Glc:Gal:Rha foi estimada em 27:7:14 quando 2,5-anidromanitol estimado como estando na extremidade redutora, foi definido como 1. Julgando pela proporção destes constituintes e pela proporção integral do espectro ¹H NMR, a estrutura de Fr. 1 (X’×6 + S’) foi atribuída da seguinte forma: {6[Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]Glcβ1}₆-6[Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]anidromanitol.

Estrutura do Fr. 2

A partir dos resultados da análise do açúcar constituinte foi inferido que o Fr. 2 compreendia 14 açúcares, porque a proporção de Glc:Gal:Rha em relação a um resíduo de 2,5-anidromanitol foi de 7:2:4. Comparando a análise ¹H NMR do Fr. 3 e Fr. 2 foram observados seis sinais de prótons anoméricos para o Fr. 3; no entanto, para o Fr. 2, foi observado outros sete sinais adicionais. Ao comparar os espectros ¹H NMR, ¹³C NMR e HSQC de Fr. 2 e Fr. 3, a estrutura do Fr. 2 foi estimada como tendo uma configuração (X’+S’) onde, além do 7-resíduo de Fr. 3 (referido como Y’), um segmento com anidromanitol substituído por Glc (referido como X’) na extremidade redutora de Fr. 3 estava vinculado a Gal na extremidade não redutora: [Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]Glcβ1-6[Glcβ1-2]Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]anidromanitol.

Estrutura do Fr. 3

A partir da análise da composição do açúcar foi estimado que Fr. 3 contém aproximadamente 7 açúcares, isto é, 3 resíduos Glc, 1 resíduo Gal, 2 resíduos Rha e 1 resíduo GlcNAc. Anteriormente, a análise de espectroscopia de correlação total (TOCSY) e correlação heteronuclear de quantum único (HSQC)-TOCSY de polissacarídeos mostrou que é possível observar prótons do mesmo sistema de spin estabelecendo um longo tempo de mistura. Para análise HSQC-TOCSY de Fr.3, foi definido um longo tempo de mistura de 150 ms.

Posteriormente, os sinais de correlação da posição C1 (carbono anomérico) para a posição do carbono C6 foram avaliados para sinais de prótons anoméricos de ¹H NMR números 1  (δ4,7), 2 (δ4,5) e 5 (δ5,0). Para Gal, a configuração molecular do grupo hidroxila na posição C4 é diferente daquela para Glc, e as constantes de acoplamento (J_H4,H5) nas posições C4 e C5 foram inferiores a 1Hz. Como a correlação foi bloqueada na posição C4, foram obtidos apenas quatro sinais de correlação. Portanto, os números de prótons 1, 2 e 5 foram atribuídos aos prótons anoméricos de Glc e o número 6 foi atribuído a Gal.

Além disso, a configuração anomérica das ligações glicosídicas foi avaliada utilizando análise de correlação heteronuclear a múltiplas ligações (HMBC). Para o espectro ¹H NMR, as constantes de acoplamento (JC_H) do carbono/próton anomérico são geralmente observadas na faixa de 160-170 Hz, que é diferente das constantes de acoplamento em outras posições (menos de 145 Hz). Sabe-se que as ligações α-coordenadas têm um valor de ~170 Hz, e as ligações β-coordenadas têm um valor de 160 Hz; a diferença é de ~10 Hz.  Os resultados resumem as constantes de atribuição e ligação para o sinal anomérico, a atribuição das posições C2-C6 por COSY e o sinal de correlação com o resíduo de açúcar adjacente obtido do HMBC. Estes resultados mostraram que βGlc (sinal nº 1) está ligado a αGal (nº 11) e às posições anoméricas dos três resíduos de açúcar βGlc (nº 2), αRha (nº 4) e αGlc (nº 5) que estão todos ligados e ramificam-se do 2,5-anidromanitol (No. 7), que é gerado pela decomposição do GlcNAc. Da mesma forma, βRha (No. 3) está ligado a βGlc (No. 2) e αGal (N^o. 6) está ligado a βRha (N^o. 3).

O modo de ligação do 2,5-anidromanitol foi analisado via análise de espectro HMBC.  Dos grupos hidroximetileno (sinal N^o. 35 e 36), o N^o. 35 é presumivelmente C₆ porque um pico de intersecção é observado com o αGlc adjacente (N^o. 5), resultando no N^o. 36 como C₁. Análise do grupo metino revelaram picos cruzados entre os sinais N^o. 7 e N^o. 9, N^o. 8 e N^o.9 e 10, N^o. 9 e N^o. 7, e N^o. 10 e N^o.  8. Além disso, foram observados picos cruzados entre N^o. 7 e o βGlc adjacente (N^o. 2) e o N^o. 9 e o αRha adjacente (N^o.4). Com base nesses resultados, o N^o. 7 foi atribuído à posição C₄, N^o. 8 a C₂, N^o. 9 a C₃, e N^o. 10 a C₅. Entre os resíduos de açúcar que constituem o Fr. 3, a posição de ligação ao αGal restante indica que o carbono anomérico (sinal N^o. 6) e o grupo metino (N^o. 11) em αGal eram o mesmo resíduo de açúcar.

Foi avaliada a correlação entre o grupo metino (N^o. 11) e βGlc (N^o. 1) via HMBC e utilizando os resultados de degradação da metilação de Fr. 3, e descobriu que βGlc (N^o. 1) estava ligado à posição 2 de αGal (N^o. 6). Em resumo, a metilação de LCPS-1 rendeu 1,2,5,6-tetra-O-acetil3,4-di-O-metil galactitol (→2,6Gal1→), enquanto o Fr. 3 (desaminação) rendeu 1,2,5-tri-O-acetil-3,4,6-tri-o-metil galactitol (→2Gal1→) e Fr. S (degradação controlada de Smith) rendeu Rha-eritritol, GlcNAc-glicerol e Glc-glicerol. Depois de avaliar os dados, foi inferida a seguinte estrutura para o Fr. 3: Glcβ1-2Galα1-3Rhaβ1-4Glcβ1-4[Rhaα1-3][Glcα1-6]anidromanitol.

Estrutura inferida do LCPS-1

A estrutura primária do LCPS-1 foi avaliada a partir dos resultados obtidos. Rha1→2eritritol, GlcNAc1→1glicerol e Glc1→1glicerol foi obtido na proporção de 3:2:1 após degradação controlada de Smith. Depois de realizar múltiplas degradações de desaminação, embora rendimentos constantes para Fr. 1 e Fr. 3 tenham sido obtidos, o rendimento de Fr. 2 foi instável. Portanto, Fr. 2 pode ser um produto de decomposição que é ocasionalmente gerado por reações secundárias, e a estrutura repetitiva principal pode ser composta por Fr. 1 e Fr. 3. As proporções aproximadas de açúcares constituintes (Glc:Gal:Rha) dos produtos de desaminação (com 2,5-anidromanitol definido para 1) foram as seguintes: Fr. 3 (3:1:2); Fr. 2 (7:2:4) e Fr. 1 (27:7:14). Portanto, dado que o Fr. 1 é composto por 49 açúcares e X e Y têm sete açúcares como unidade básica, Fr. 1 é considerado como tendo sete unidades de açúcar (X₆Y). Portanto, considerando que X e Y existem em uma proporção de 1:2, o LCPS-1 parece ter uma estrutura repetitiva de 6 unidades X com 12 unidades Y atrás dela (X₆S₁₂). Com a determinação da estrutura primária do LCPS-1, acredita-se que a elucidação da função imunomoduladora do LcS irá progredir no futuro.

O-desacetilação de LCPS-1

Como o sinal δ5.6 observado na região anomérica espectro ¹H NMR de LCPS-1 correlacionado com um sinal próximo de δ70 no espectro ¹³C NMR, foi inferido que este sinal não corresponde a um próton anomérico. Quando LCPS-1 foi submetido à seleção O-desacetilação, o sinal δ5.6 e o sinal δ2.2 acetil metil estavam ausentes. A falta desse sinal foi confirmada por desaminação e fracionamento utilizando Bio-gel P2. Os picos de correlação foram analisados usando o HSQC-TOCSY e espectros COSY do LCPS-1. Como um pico cruzado foi formado entre o próton de δ5.6, o próton anomérico e o próton metila de βRha, foi inferido que o grupo O-acetil estava ligado a βRha. Além disso, foi observado um sinal de correlação entre o próton anomérico βRha e o sinal δ5.6 do espectro COSY, e concluído que o grupo O-acetil está ligado à posição 2 de βRha.

Acoplamento de GlcNAc e βGlc a αGal

O (→2,6Gal1→) identificado durante a análise de metilação de LCPS-1 tornou-se (→2Gal1→) via desaminação. Foi inferido que GlcNAc e βGlc estavam ligados à posição 6 de αGal, e a hipótese foi apoiada pelos resultados da degradação controlada de Smith de LCPS-1 e pelos vários espectros de NMR 1D e 2D de LCPS-1.

Estruturas básicas que compõem o LCPS-1

X’ e Y’, que constituem o Fr. 1, 2 e 3, são as unidades estruturais básicas do LCPS-1. Foi inferido que tanto X quanto Y consistem em sete açúcares nos quais um grupo O-acetil está ligado à posição 2 do βRha de cadeia linear a partir dos resultados da O-desacetilação de LCPS-1.

Análise experimental de LCPS-1 e PS-PG1

As células foram colhidas por centrifugação e lavadas repetidamente com solução salina tamponada com fosfato

LcS foi cultivado no meio MRT

O LcS foi cultivado no meio MRT a 37°C por 16 horas, sem agitação. As células foram colhidas por centrifugação e lavadas repetidamente com solução salina tamponada com fosfato (-) até o pH do tampão ser 6,0. Foi obtido um rendimento de ~1,5 g de pellet celular úmido/L de cultura. As células foram ressuspensas em solução salina fisiológica e liofilizada, obtendo 9.4 g de células secas. As células liofilizadas (9.4 g) foram ressuspensas em 300 mL de água e aquecidas em autoclave a 121°C por 30 min. Após resfriamento, a suspensão foi centrifugada (19,650×g, 30 min) e o sobrenadante foi coletado. O sedimento celular foi lavado três vezes com água. O sobrenadante e as lavagens foram combinados e concentrados até ~100 mL por um evaporador (Rotavapor R-210; Buchi, Flawil, Suíça) e etanol foi adicionado a uma concentração de 70% para formar um precipitado.

O precipitado foi dissolvido em água e dialisado contra água usando uma membrana de diálise (Spectra/Por 1, MWCO 6000-8000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) a 5°C e liofilizado para obter polissacarídeos brutos (o rendimento foi de ~820 mg). Os polissacarídeos brutos foram dissolvidos em um pequeno volume de solução de NH₄HCO₃ 50 mM, e a solução foi submetida à filtração em gel em uma coluna Sephacryl S-300 HR (2,6 x 60 cm; Cytiva, Marlborough. MA, EUA) a uma vazão de 0,3 mL/min. Os açúcares neutros em cada fração foram quantificados pelo método do ácido fenol sulfúrico, e as frações dos picos foram combinadas. As frações foram concentradas utilizando um evaporador, dessalinizadas com um acilizador e liofilizadas para obter 108 mg de LCPS-1 purificado. PS-PG1 foi preparado usando N-acetilmuramidaze SG conforme descrito anteriormente.

Degradação controlada do ferreiro do LCPS-1

O LCPS-1 foi submetido à degradação de Smith usando os métodos padrão descritos anteriormente. Primeiro, 20 mg de LCPS-1 foram dissolvidos em 600 μL de água. Em seguida, foi adicionado sequencialmente 1 mL de solução aquosa de 0,2 M NaIO₄, 200 μL de 0,5 tampão de acetato de sódio M (pH 5,0) e 200 μL de água em agitação contínua. A solução foi protegida da luz com papel alumínio e agitada a 5°C por 20 horas para clivar os dióis vicinais. Após adicionar 10 μL de etilenoglicol à solução e agitar a 5°C por 4h, foi adicionado 1 mL de solução de borato de sódio 0,2 M (pH 8,0). Em seguida, 1 mL de solução aquosa de NaBH₄ 1M foi adicionado gota a gota e a reação redutora foi mantida a 5°C por 20 horas. A reação foi interrompida pela adição de ácido acético e a solução reacional foi dialisada contra água usando uma membrana Spectra/Por 1 (Thermo Fisher Scientific) a 5°C e liofilizada. O produto da reação foi dissolvido em 1 mL de solução aquosa de HCl 0,5 M e reagiu a 25°C por 16 horas para induzir degradação controlada e obter oligossacarídeos. A solução reacional foi neutralizada com NaOH 0,6 M e centrifugada a 10.000xg por 10 min para obtenção do sobrenadante. O sobrenadante foi diluído com uma pequena quantidade de água e fracionado usando uma coluna Sephadex G-25 (26 × 600mm; Cytiva) com água a uma vazão de 0,6 mL/min. Os açúcares neutros em cada fração foram quantificados pelo método fenol-ácido sulfúrico.

Desaminação de LCPS-1

Resumidamente, 20 mg de LCPS-1 foram desacetilados com 120 mg de tiofenol de sódio e 4 mL de metilsulfinilmetaneto de potássio 2,5 M a 100°C por 15 h. A solução de reação foi dialisada contra água a 5°C usando uma membrana de diálise (Spectra/Por 1, MWCO 6000-8000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e depois liofilizada para obter LCPS-1 N-desacetilado. Ao LCPS-1 N-desacetilado foram adicionados 1 mL de KHSO₄ a 5% e NaNO₂ a 5% de cada para realizar a desaminação, e a mistura reacional foi mantida a 25°C por 16h. A reação foi encerrada adicionando 1,0 mL de solução aquosa de sulfamato de amônio a 12,5%, e a solução reacional foi seca e concentrada usando um evaporador centrífugo (VC-36; TAITEC, Koshigaya, Saitama, Japão). Ao resíduo foi adicionado 1,0 mL de solução aquosa de NaBH₄ 1 M e a redução foi realizada a 5°C por 20h. Em seguida, foi adicionado ácido acético e a mistura foi dessalinizada, seca e concentrada utilizando um evaporador centrífugo. Os produtos foram fracionados em coluna Bio-gel P2 (16 × 600 mm; BioRad, Hercules, CA, EUA), com água a uma vazão de 0,3 mL/min. O açúcar neutro em cada fração foi analisado pelo método fenol-ácido sulfúrico.

O-desacetilação do LCPS-1

LCPS-1 (20 mg) foi tratado com 0,5 mL de hidrazina anidra (reagente Cosmo Bio Hydrazinolítico Y) a 100°C por 8h. A solução reacional foi diluída com água, neutralizada com ácido sulfúrico concentrado, concentrada e dialisada contra água a 5°C usando uma membrana Spectra/Por 1 (Thermo Fisher Scientific). A solução dialisada foi liofilizada e rendeu ~18,8 mg de produto des-O-acetilado.

Métodos gerais e analíticos para LCPS-1

Análise da composição de monossacarídeos

Após degradação da amostra em solução aquosa de ácido trifluoroacético (TFA) 4 M a 100°C por 2h, a amostra foi submetida ao método de derivatização de 1-fenil-3-metil-5-pirazolona (PMP) conforme descrito por Honda e colaboradores usando talose (N^o. 1634; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como padrão interno. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada utilizando uma coluna Symmetry 300 (4,6 × 250mm) com eluição a 1,0 mL/min utilizando tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 6,0)/CH₃CN (82/18) a 35°C, e os eluatos foram analisados utilizando um detector UV a 245 nm.

Análise de açúcar e álcool de açúcar

As frações de LCPS-1 derivadas da degradação controlada de Smith (açúcar/álcool de açúcar) foram posteriormente degradadas usando uma solução aquosa de TFA 4 M a 100°C por 2h e o produto foi analisado usando cromatografia gasosa através do método de derivatização de trimetilsilil. As condições para GC foram as seguintes: cromatógrafo gás-líquido (HP6890; Agilent, Santa Clara, CA, EUA) equipado com coluna capilar J&W SE-52 (0,25 mm × 25 m, df = 0,3 μm; Agilent) a uma taxa de fluxo de 0,7 mL/min (He). No momento da injeção da amostra, a temperatura da coluna foi mantida por 30 min a 150°C, e então a temperatura foi aumentada até 200°C a uma taxa de 10°C/min. As temperaturas do injetor e do detector de ionização de chama foram ajustadas em 250°C.

Linkage type determination of glycosides

As posições de ligação do açúcar foram determinadas através da análise dos acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs). A análise de metilação foi realizada de acordo com um método descrito anteriormente usando hidróxido de sódio em pó e iodeto de metila. A quantidade de PMAA obtida foi medida via GC (HP6890; Agilent) e GC-MS (JMS700v; JEOL, Akishima, Tóquio, Japão).

Medição LC/Q-TOF-MS

O espectro de massa do álcool de açúcar foi medido no modo de injeção em fluxo (FI) e no modo LC/MS usando LC/Q-TOF-MS (QSTAR Elite; Sciex, Framingham, MA, EUA) equipado com ionização por eletrospray. A FI foi realizada a 40°C usando HCOONH₄ 10 mM (pH 6,5)/CH3CN (1/1) a uma vazão de 0,3 mL/min. As condições de HPLC para LC/MS foram as seguintes: foi usada uma coluna Unison UK-Amino (3,0 × 250 mm, 3 μm; Imtakt, Shimogyo-ku, Kyoto, Japão), a temperatura da coluna foi mantida a 50°C e a eluição foi realizada a uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min usando HCOONH₄ 10 mM (pH 6,5)/CH₃CN (75/25).

Espectroscopia de NMR

Os espectros de ¹D 1H e ¹³C e 2D COSY, TOCSY, HSQC, HMBC e híbrido HSQC-TOCSY foram medidos em 99,8% D₂O a 30°C ou 60°C usando espectrômetros de NMR (ECA com gradiente de campo magnético H5XFG3; JEOL e Espectrômetro NMR DD2 de 700 MHz com sonda fria aprimorada de ressonância tripla ¹³C, VT700NB). 3 Trimetilsililpropanato-2,2,2,3-d4 (δH0,δC-1.6) foi usado como material de referência. Os espectros foram processados utilizando os softwares padrão Delta 5.05, JEOL e VnmrJ 4.2 (Agilent), respectivamente, equipados com cada máquina.

LCPS-1 ou o oligossacarídeo derivado da degradação de LCPS-1 foi dissolvido em D₂O e colocado em um tubo NMR de 5 mm ou em um microtubo simétrico (BMS-005 V; Sigemi Co. Ltd., Hachioji, Tóquio, Japão). Experimentos 2D TOCSY e híbrido HSQC-TOCSY foram realizados com tempos de mistura de 150 ms. O experimento HSQC foi otimizado para J = 160 Hz (para correlações
¹H-¹³C diretamente ligadas), e o experimento HMBC foi otimizado para constantes de acoplamento de 4 ou 8 Hz (para correlações ¹H-¹³C de longo alcance). Para o experimento HSQC, foi realizado o desacoplamento no lado de 13C NMR.

O experimento sem desacoplamento no lado da ¹³C NMR também foi realizado para obter informações sobre as ligações α- e β- das cadeias de açúcar. Outros parâmetros foram empregados de acordo com os valores recomendados pelo fabricante. O estudo ‘Structural determination of the cell wall polysaccharide LCPS-1 in Lacticaseibacillus paracasei strain Shirota YIT 9029’ ou ‘Determinação estrutural do polissacarídeo LCPS-1 da parede celular no Lacticaseibacillus paracasei Shirota YIT 9029’ foi publicado no Carbohydrate Research 521 (2022) 108670 – doi: 10.1016/j.carres.2022.108670. •

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