Efeitos do LcS na microbiota da placa dental
Estudo foi o primeiro a investigar os efeitos da cepa probiótica por meio de sequenciamento do 16S rRNA
A cárie dentária é uma doença de biofilme complexa que envolve uma perda líquida de minerais dos dentes devido a períodos prolongados de baixo pH na boca. Com impactos negativos na qualidade de vida, também afeta negativamente a frequência escolar e o desempenho nos estudos, e é um dos principais motivos de hospitalização de crianças em alguns países de alta renda. Os esforços para prevenir a cárie dentária incluem a fluoretação da água, cremes dentais com flúor, verniz de flúor, selantes e/ou restaurações terapêuticas provisórias e diamino fluoreto de prata, cada um dos quais mostrou níveis variados de eficácia em ensaios clínicos. Embora a prevalência tenha diminuído na maioria dos países industrializados desde a década de 1970, a cárie dentária continua sendo a doença não transmissível mais comum em todo o mundo. Assim, novos métodos para a prevenção permanecem em demanda urgente.
A terapia com probióticos foi introduzida para a manutenção da saúde bucal, mas estudos com a mesma cepa probiótica apresentaram resultados conflitantes. O Lactobacillus casei Shirota (LcS), que está presente na bebida láctea fermentada Yakult, tem mais de 80 anos de história de consumo seguro e benefícios comprovados para a saúde. O LcS demonstrou inibir significativamente o crescimento in vitro de Streptococcus mutans e reduzir a quantidade de S. mutans na saliva e placa dentária. No entanto, outro estudo não encontrou nenhuma mudança significativa na viabilidade de S. mutans, microrganismos acidogênicos, espécies anaeróbias totais e bactérias gram-negativas anaeróbias obrigatórias na saliva e na saburra lingual de usuários saudáveis de próteses totais após a administração de LcS. Devido a esses achados contraditórios, os impactos potenciais na microbiota oral do consumo de LcS permanecem incertos e nenhuma proposta específica baseada em evidências foi estipulada para o uso de probióticos para prevenir doenças da cavidade oral.
Os estudos mencionados acima se concentraram principalmente nos efeitos do LcS em espécies bacterianas únicas, examinadas por cultura em placas in vitro e contagem de colônias, e não observaram o impacto do probiótico na microbiota oral geral. O sequenciamento do 16S rRNA permite uma análise mais detalhada das comunidades microbianas, permitindo a detecção não apenas dos microrganismos mais abundantes, mas também daqueles de baixa abundância. Até o momento, não há relatos confiáveis de espécies e diversidade genotípica na cavidade oral após o consumo do Yakult. Portanto, este estudo foi conduzido para explorar os efeitos do L. casei Shirota na composição e estrutura da microbiota oral usando a análise da sequência de 16S rRNA. Até onde se sabe, este é o primeiro estudo a investigar tais efeitos por meio de sequenciamento do 16S rRNA.
Este estudo de caso controlado recrutou estudantes saudáveis com idades entre 20 e 22 anos, que frequentavam a Sun Yat-sen University, entre novembro e dezembro de 2016. Os critérios de inclusão foram autorrelato do estado de saúde e dentição completa. A cavidade oral de cada indivíduo foi verificada por um dentista experiente (XH) e foram excluídos indivíduos com menos de 28 dentes; sinais clinicamente detectáveis de cárie (lesão de mancha branca ou cavidade cariosa); doença periodontal (sangramento gengival, bolsa periodontal profunda, perda de inserção e mobilidade dentária) ou outras patologias como sinusite, bolhas e inchaço; restaurações dentárias, coroas ou aparelhos ortodônticos; fumantes atuais ou coabitantes fumantes; participação atual em outro estudo clínico; uso de antibióticos ou probióticos três meses antes do exame. Indivíduos com doenças atuais ou com histórico de doenças associadas à microbiota oral, como diabetes mellitus, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal e aterosclerose também foram excluídos. O estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Guanghua School and Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University (KQEC-2019-01), e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito.
Desenho do estudo
Para cada indivíduo, a placa dentária supragengival foi coletada das superfícies dos quatro primeiros molares na manhã do dia 1, ou seja, no ponto A, pelo menos 24 horas após a última escovação e 12 horas após a última ingestão de alimentos. Os indivíduos foram instruídos a consumir 100ml de Yakult (Yakult Sdn Bhd, Selangor Darul Ehsan, Malásia) três vezes no dia 1: um frasco imediatamente após a amostragem, um após o almoço e outro após o jantar, fazendo bochechos com a bebida na boca por cerca de 20s para prolongar o tempo de contato com os dentes antes de engolir. Os participantes também foram instruídos a consumir um frasco após o almoço diariamente do dia 2 ao dia 29 de acordo com o método acima. A placa dentária supragengival foi coletada na manhã do dia 2 (momento B) e dia 30 (momento C). Durante o estudo, os voluntários foram instruídos a manter seu regime regular de higiene oral, exceto nas 24 horas anteriores às coletas de amostras nos dias 1, 2 e 30. Todas as amostras orais foram coletadas no Guanghua Institute of Stomatological Research, Sun Yat-sen University, e imersas em 4ml de solução salina esterilizada a 0,9% e armazenadas em -80°C antes da extração do DNA. Os leites fermentados foram adquiridos em lojas de Guangzhou e armazenados a 4°C-6°C antes do consumo, conforme as instruções do fabricante. Cada frasco de Yakult (100ml) foi declarado pelo fabricante como contendo 1,2×10¹º unidades formadoras de colônias (UFC) de L. casei Shirota.
PROCESSO DE SEQUENCIAMENTO
Para minimizar os efeitos dos dados de baixa qualidade, os dados brutos gerados pelo pirosequenciamento foram pré-processados antes de uma análise mais aprofundada. Primeiro, os dados brutos foram divididos em amostras individuais de acordo com o código de barras. Em seguida, as leituras pareadas obtidas do sequenciamento de terminal duplo foram montadas em uma sequência de acordo com sua relação de sobreposição usando o software Connecting Overlapped Pair End (COPE), versão V1.2.3.3. O comprimento da sequência de sobreposição foi de 19 pares de bases (pb) e a taxa de correspondência foi fixada em 98%. O código de barras e a sequência do iniciador foram, então, removidos por um script interno. Nenhuma incompatibilidade foi permitida para o código de barras, enquanto um bp de incompatibilidade foi permitido para o primer. As tags emendadas foram agrupadas de acordo com seus comprimentos e as sequências quiméricas foram removidas. Finalmente, uma tabela estatística do nível de classificação da Unidade Taxonômica Operacional (UTO) foi obtida de acordo com as estatísticas dos dados. As sequências brutas foram depositadas no NCBI Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.n h.gov/sra) com os números de acesso SRR8497113 SRR8497142.
EXTRAÇÃO DE DNA E POLIMERASE REAÇÃO EM CADEIA
O DNA foi extraído de amostras de placas usando um kit de isolamento de DNA Powersoil (MO BIO Laboratories, QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi usada para gerar bibliotecas de amplicon das regiões hipervariáveis V4 e V5 do gene ribossomal (r)RNA de subunidade pequena (16S) para cada amostra individual. A PCR foi realizada usando primers universais (direto, 5’-GTGACAGCA CCGCGGTAA-3’ e reverso, 5’-CCGTCAATTTATTTAAGTTT-3’ [HonorTech Co., Pequim, China]) com 30 códigos de barras que ajudaram a atribuir sequências a diferentes amostras. A mistura de amplificação continha 30 ng de amostra de DNA, 2 μl de primer direto (10 μM), 2 μl de primer reverso (10 μM), 4 μl de dNTPs (2,5 mM), 5 μl de iniciador 10 PyrobestTM (TaKaRa, Tóquio, Japão), 0,3 μl de PyrobestTM DNA Polymerase (2,5 U/μl; Código, DR005A; TaKaRa) e 36,7 μl de ddH2O em um volume total de 50 μl. As condições de ciclagem foram uma denaturação inicial a 95°C por 5 min, 30 ciclos de denaturação a 95°C por 30s, anelamento a 56°C por 30s e alongamento a 72°C por 40s, seguido por uma extensão final por 10 min a 72°C, com as amostras mantidas a 4°C. Cada amostra foi amplificada usando um primer específico com código de barras. Para avaliar a qualidade, o produto de PCR para cada amostra foi submetido a eletroforese usando um gel de agarose a 3% e visualizado usando um UVP BioDoc-IT2 UV Imaging System (Analytik Jena, Upland, CA, EUA). Fragmentos de DNA foram retirados do gel e, posteriormente, purificados usando QIAquick Gel Extraction Kit (250) (Cat No./ID: 28706; QIAGEN GmbH). Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foi usado para determinar a concentração de produtos de PCR. Finalmente, uma biblioteca de amplicons foi construída e o pirosequenciamento dos amplicons 16S PCR foi realizado usando o sistema IlluminaVR MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.
Bactérias associadas à cárie
Dos 12 estudantes recrutados, 10 completaram o estudo (nomeados de 1 a 10) e foram incluídos nas análises finais. Trinta amostras, 10 para cada ponto de tempo (A1-10, B1-10, C1-10) foram coletadas e analisadas. O sequenciamento de amplicon 16S rDNA com código de barras usando a plataforma Illumina MiSeq rendeu 978.091 leituras brutas (sequências UTO), resultando em um conjunto de dados de 256.814 leituras (tamanho da amostra). O número de leituras por amostra variou de 5.891 a 12.571, com média de 8.560. As análises de riqueza e diversidade foram baseadas em UTO, e agrupar as sequências únicas em UTO a uma distância genética de 3% resultou em 170-234 filotipos diferentes em ‘nível de espécie’ por amostra. Para todas as amostras analisadas, o número de UTO detectado (125-234) foi muito próximo do número total de UTO estimado pelo indicador de riqueza Chao1 (144-278). Usando o método de Good, o nível médio de cobertura foi de aproximadamente 99,8% em todas as amostras, indicando que aproximadamente dois novos filotipos seriam esperados para cada 1.000 leituras sequenciadas adicionais. Este nível de cobertura sugere que as sequências de 16S rDNA identificadas representam a maioria dos tipos bacterianos presentes nas amostras do estudo atual.
Curvas de rarefação foram analisadas para amostras individuais e para amostras agrupadas para cada um dos três pontos de tempo. Curvas de rarefação entre os três grupos de tempo mostraram riqueza de espécies semelhante, sem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (P>0,05). Usando diferentes medidas de diversidade alfa (número de UTO observado, Índice de Chao1, Índice de Shannon e árvore inteira de Diversidade Filogenética) consistentemente foram encontradas comunidades microbianas semelhantes dentro dos três grupos de pontos de tempo (P>0,05). Para determinar se a microbiota dos três grupos de tempo poderia ser distinguida, o PCA foi empregado. Essa técnica extraiu as informações importantes de um conjunto de dados multivariado e as visualizou em uma dimensão eliminada. Nenhuma tendência aparente de agrupamento foi observada, indicando que a estrutura geral da microbiota da placa não foi afetada pela ingestão do probiótico.
Os efeitos na estrutura da microbiota de diferentes momentos, sujeitos e consumo do Yakult vs linha de base (por momento, por sujeito e por consumo) foram avaliados usando ANOSIM, com base na dissimilaridade de Bray-Curtis. Os valores de R resultantes foram todos maiores que zero, sugerindo que as diferenças entre os momentos, consumo do Yakult e o controle da linha de base, e entre os indivíduos, tendiam a superar as diferenças correspondentes dentro do grupo. No entanto, apenas as diferenças entre e dentro dos sujeitos foram estatisticamente significativas (P<0,001). A caracterização baseada em taxonomia da microbiota da placa dentária foi realizada identificando e quantificando táxons bacterianos em bancos de dados de referência usando o software mothur. As comunidades microbianas da placa foram perfiladas taxonomicamente, resumindo as abundâncias relativas de clados microbianos em diferentes níveis taxonômicos. Todas as sequências foram distribuídas em 23 filos, 48 classes, 82 ordens, 113 famílias, 184 gêneros e 253 espécies.
Abundância
Os cinco filos mais abundantes foram Firmicutes (7,5%-53,7%), Proteobacteria (7,2%-50,3%), Bacteroidetes (6,9%-27,3%), Actinobacteria (5,6%-22,2%) e Fusobacteria (1,9%-33,2%), compreendendo 93,2%-99,8% da comunidade de todas as amostras. No nível de gênero, Veillonella, Aggregatibacter, Streptococcus, Leptotrichia, Neisseria, Corynebacterium, Fusobacterium e Porphyromonas representaram quase 70% das leituras totais. Amostras dos participantes 8 e 10 tinham porcentagens mais altas de Veillonella (25,9%-39,5%) vs outros indivíduos (0,2%-11,0%), exceto para as amostras C3 e C4. Moraxella apresentou uma porcentagem relativamente alta (5,0%-15,5%) nas amostras do participante 7. Capnocytophaga, Actinomyces, Prevotella 7, UN–f-Neisseriaceae, Prevotella, Prevotella 2 e Alloprevotella também foram encontrados em todas as amostras com distribuições quantitativas desiguais. Nenhum nível detectável de S. mutans foi encontrado nas amostras do estudo. Para estudar as mudanças na composição da microbiota da placa dentária após a ingestão do LcS foi feita comparação entre os momentos. Entre os cinco filos dominantes, Proteobacteria e Firmicutes mostraram abundâncias relativas significativamente diferentes entre os três momentos. A abundância relativa do Proteobacteria foi significativamente menor no momento C vs A e B (P<0,05), enquanto a abundância relativa de Firmicutes foi significativamente maior nos momentos B e C em comparação ao A (P<0,05 e P<0,01, respectivamente).
Ao nível do gênero, a abundância relativa de Veillonella mostrou uma tendência crescente após o consumo do probiótico, mas apenas a diferença entre A e C foi estatisticamente significativa (P<0,05). Por outro lado, a abundância relativa de Leptotrichia diminuiu após a ingestão do probiótico (momento A vs B; P<0,05), mas não foi significativamente diferente da linha de base no momento C (um dia após o final da ingestão do LcS). Abiotrophia e Gemella apresentaram uma abundância relativa significativamente maior no momento B vs C (P<0,05), enquanto apenas Abiotrophia apresentou uma abundância relativa maior no momento B vs A (P<0,05). A abundância relativa de Kingella foi significativamente maior no momento C vs A e B (P<0,05 e P<0,01, respectivamente). Não houve mudanças significativas na abundância relativa de Actinomyces e Lactobacillus após o consumo do L. casei Shirota (dados não mostrados).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados são apresentados como prevalência n ou %, ou DP médio, e as análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS, versão 22.0 (IBM, Armonk, NY, EUA) para Windows®. A normalidade dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro-Wilk, e o teste de Levene foi usado para avaliar a homogeneidade da variância antes da seleção de testes paramétricos ou não paramétricos apropriados. As diferenças nos dados foram analisadas usando análise paramétrica de variância (ANOVA) ou teste não paramétrico de Friedman. Análises de componentes principais foram empregadas para investigar as diferenças entre a microbiota de acordo com o tempo. As diferenças na estrutura da microbiota de acordo com o ponto de tempo, sujeito e consumo de Yakult foram avaliadas usando análise de semelhanças (ANOSIM) com base na dissimilaridade de Bray-Curtis. Este método amplamente utilizado apresenta as diferenças amostrais como valores que variam de 0 a 1, onde um valor de diferença de 0 indica que as amostras compartilham todas as suas espécies e um valor de 1 indica que as amostras são totalmente diferentes. Um valor ‘R’ foi usado para comparar dissimilaridades dentro e entre grupos, onde R>0 indica maiores distâncias entre grupos (diferenças) do que distâncias dentro do grupo. Para todas as análises, um valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Discussão
A cavidade oral tem sido alvo para testar várias cepas de probióticos. No presente estudo, a análise dos dados revelou mudanças na abundância de algumas bactérias associadas à presença ou ausência de cárie, enquanto a estrutura geral da microbiota permaneceu inalterada. Em particular, foram observadas alterações em alguns gêneros associados à cárie, sendo Veillonella o mais dominante nas amostras – que aumentou significativamente em relação à linha de base após o consumo do L. casei Shirota por quatro semanas. A Veillonella é capaz de utilizar o lactato e metabolizá-lo em ácidos mais fracos, o que pode ajudar a retardar o processo de desmineralização. Muitos estudos já investigaram os efeitos de LcS na microbiota oral, particularmente S. mutans ou estreptococos mutans, mas os dados são conflitantes.
A análise taxonômica não encontrou nenhum nível detectável de S. mutans e nenhuma mudança significativa na abundância relativa de estreptococos não mutans, Actinomyces e Lactobacillus após o consumo do LcS (dados não mostrados), embora o Leite Fermentado Yakult seja rico em carboidratos (17% p/p). Por muitos anos, S. mutans foi enfatizado como tendo um papel crítico na cárie dentária, mas estudos revelaram que não é mais apropriado relacioná-lo como principal agente etiológico, uma vez que a microflora envolvida na cárie é muito mais complexa do que se pensava e outras bactérias, como estreptococos não mutans, Actinomyces, Lactobacillus, Bifidobacterium e Propionibacterium podem se comportar exatamente da mesma maneira que S. mutans.
A placa dentária é um ecossistema dinâmico no qual estreptococos não mutans e Actinomyces são os atores-chave. O suplemento de açúcar reduz o pH do ambiente, o que aumenta o número de bactérias-chave e provoca uma mudança na microflora, levando o ecossistema à desmineralização. Somente quando o ambiente ácido é prolongado os estreptococos mutans e lactobacilos tomarão o lugar dos estreptococos não mutans e Actinomyces e acelerarão a perda líquida de minerais. Uma vez que a maioria (>90%) das espécies microbianas não pode ser prontamente cultivada usando as técnicas atuais de cultura de laboratório, a cultura convencional em placas e a contagem de colônias são insuficientes na análise da microbiota.
A fim de obter uma visão mais profunda da microbiota da placa, este estudo envolveu o sequenciamento do 16S rRNA. A técnica foi usada para compilar a maioria dos dados coletados pelo Projeto Microbioma Humano e os principais filos encontrados nas amostras deste estudo concordaram com os resultados do Projeto. Com cobertura de até 99,8%, a diversidade alfa não mudou significativamente após a ingestão do L. casei Shirota como marcador de riqueza de espécies. Além disso, o PCA não mostrou agrupamento aparente por pontos no tempo, consistente com os resultados do ANOSIM, nos quais as diferenças entre os pontos no tempo e entre as intervenções não superavam significativamente as diferenças dentro dos pontos no tempo e nas intervenções, respectivamente. Esses resultados indicaram que a estrutura geral da microbiota não foi significativamente afetada pela ingestão do probiótico, ecoando parcialmente os achados de outros estudos.
Acredita-se que a microbiota oral seja a comunidade microbiana mais estável em comparação com outras comunidades do corpo, e a placa dentária exibe uma organização complexa que permanece estável com o tempo, apesar das mudanças no ambiente oral. Portanto, a intervenção para alterar sua estrutura geral pode não ser fácil. Como primeiro estudo a investigar os efeitos do LcS na microbiota do biofilme dental por meio do sequenciamento 16S rRNA, o tamanho relativamente pequeno desta amostra (n=10) foi comparável a estudos anteriores, e os resultados fornecem informações valiosas para análises metagenômicas completas em grande escala.
Em conclusão, a ingestão de Yakult alterou a abundância de algumas bactérias relacionadas à cárie, enquanto a estrutura geral da microbiota permaneceu inalterada. A mudança na composição pode ser benéfica para a saúde bucal, mas análises adicionais da acidogenicidade do biofilme e outras mudanças na atividade enzimática são necessárias para verificar se a ingestão contínua de probióticos por períodos mais longos pode ter um impacto significativo na microbiota da placa dentária.
Tradução do artigo ‘Effects of a probiotic drink containing Lactobacillus casei strain Shirota on dental plaque microbiota’ publicado no Journal of International Medical Research 2019, Vol. 47(7) 3190-3202 – DOI: 10.1177/0300060519853655