A PRIMEIRA LINHA DE DEFESA CONTRA INFECÇÕES
Inflamassomas são considerados a principal plataforma de resposta inflamatória relacionada a doenças e condições fisiológicas
O sistema imunológico é formado por uma complexa rede de órgãos, células e moléculas responsáveis por manter a homeostase e combater a ação de microrganismos invasores impedindo, assim, o desenvolvimento de doenças. A imunidade inata, primeira linha de defesa do organismo contra infecções, atua em conjunto com a imunidade adaptativa – ativada após o contato com diferentes tipos de agentes infecciosos –, e caracteriza-se pela rápida resposta à agressão, independentemente de estímulo prévio. Seus mecanismos compreendem barreiras físicas, químicas, biológicas, componentes celulares e moléculas solúveis. Todas as células imunes são equipadas com um complexo multiproteico citoplasmático denominado inflamassoma. Essa plataforma intracelular é importante, pois pode desencadear vias inflamatórias relacionadas a várias doenças e condições fisiológicas, nas quais a inflamação tenha impacto importante.
Evidências da literatura descrevem os inflamassomas como poderosos mecanismos de combate a infecções por bactérias, vírus, protozoários e fungos. No entanto, também são descritos como elementos centrais na ativação de outras patologias inflamatórias, a exemplo de câncer, doenças metabólicas e transtornos neuropsiquiátricos, entre outros. “Isso ocorre quando a ativação dos inflamassomas acontece de forma exacerbada, fazendo com que o sistema imune responda a algo que não necessariamente seja perigoso ao organismo e resultando em desordens na resposta inflamatória”, relata a professora doutora Karina Ramalho Bortoluci, docente do Departamento de Farmacologia e coordenadora do Laboratório de Imunologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Com foco principal nas infecções por protozoários e vírus, seu grupo de pesquisa tem estudado mecanismos efetores mediados pelos inflamassomas para o controle de infecções causadas por agentes como Trypanosoma cruzi e vírus zika. Dentre esses, estão processos de morte celular, como a piroptose e necroptose; produção de mediadores tóxicos como o óxido nítrico; e a regulação da autofagia – processo homeostático celular de reciclagem de organelas e nutrientes.
A função dos inflamassomas no metabolismo é amplamente estudada, uma vez que mediadores pró-inflamatórios podem causar efeitos locais e sistêmicos no metabolismo. Uma boa referência é o estudo ‘Absence of the caspases 1/11 modulates liver global lipid profile and gut microbiota in high-fat-diet-induced obese mice’ desenvolvido pela doutora Lívia Pimentel Sant’Ana Dourado na Universidade de Brasília (UnB), em parceria com a Universidade McGill, no Canadá. O estudo avaliou o papel do inflamassoma NLRP3 no estabelecimento de obesidade, esteatose hepática, metabolismo lipídico e modificação da microbiota intestinal. “Dentro do inflamassoma NLRP3 tem a enzima caspase-1 que, efetivamente, faz com que as citocinas IL-1β e IL-18 se ativem e sejam liberadas da célula, induzindo a inflamação. Paralelamente, temos a caspase-11 em camundongos (equivalente às caspases-4 e 5 em humanos) que é capaz de ativar as citocinas IL-1β e IL-18 diretamente, sem a participação do NLRP3. O esperado era que, ao se retirar as caspases-1 e 11 nos camundongos haveria menos inflamação e eles ficariam menos obesos. Entretanto, o trabalho mostrou efeito contrário. No estudo, a dupla deleção das enzimas caspase-1 e 11 levou à piora da obesidade e esteatose hepática, bem como o estabelecimento de uma microbiota caracterizada por disbiose intestinal, evidenciando que o complexo do inflamassoma pode atuar também na obesidade e no metabolismo lipídico”, destaca a professora doutora Kelly Grace Magalhães, docente do Departamento de Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas e coordenadora do Laboratório de Imunologia e Inflamação da UnB, que coordenou o estudo.
Causada por um estado inflamatório sistêmico, a obesidade é uma doença crônica relacionada a várias outras patogenicidades. O grupo de pesquisa da UnB também vem estudando o efeito nocivo que a obesidade tem sobre diferentes tipos de câncer, bem como em doenças virais e, dentro desses estudos, a microbiota intestinal e a obesidade estão intimamente relacionadas. Segundo a professora, os grupos de bactérias e os metabólitos da microbiota podem desempenhar papel protetor ou nocivo ao organismo, modulando positivamente ou negativamente o estabelecimento do câncer e de outras doenças crônicas, como a obesidade. “Sabe-se que os inflamassomas estão diretamente relacionados ao processo de manutenção do estado inflamatório observado na obesidade e, dentro dessa modulação, a microbiota constitui importante fator, pois, a depender da dieta, haverá populações de bactérias diferentes colonizando o intestino e produzindo metabólitos que também poderão impactar. A desregulação do metabolismo energético, as interações com a microbiota intestinal e o mal funcionamento fisiológico do tecido adiposo podem ser mediados por processos inflamatórios”, detalha a professora.
Para entender como os inflamassomas são ativados e as inflamações ocorrem, na obesidade ou no câncer, o grupo da doutora Kelly Grace Magalhães estuda os tecidos adiposos, que possuem papéis distintos na modulação do metabolismo e da resposta imune. “Há dois tipos de tecido adiposo: o branco (WAT), amplamente distribuído e conhecido por seu papel no armazenamento de gordura e, portanto, presente em maior quantidade no indivíduo obeso; e o marrom (BAT), pouco desenvolvido em adultos obesos, mas muito ativado em atletas, pessoas submetidas ao frio ou com dietas específicas”, detalha. Na tese ‘Análise da modulação de parâmetros carcinogênicos de células de câncer de mama pelo tecido adiposo branco e marrom: o papel do inflamassoma NLRP3 neste processo’, o autor Luís Henrique Costa Corrêa Neto mostra que os tecidos adiposos exercem papel diferencial no estabelecimento e na progressão tumoral, destacando o papel antitumoral do tecido adiposo marrom (potencial alvo para a imunoterapia no tratamento do câncer de mama) e pró-tumoral do tecido adiposo branco. Nesse processo, o inflamassoma NLRP3 mostrou ser um ponto no equilíbrio inflamatório desses tecidos.
Processo é relativamente simples e envolve várias estruturas
Constituídos por diversas proteínas que se formam no citoplasma das células em resposta a infecções, danos ou estresse celular, os inflamassomas são descritos como ‘plataformas’ que ativam uma protease chamada caspase-1 – enzima que executa proteólise em proteínas –, que tem funções importantes para a defesa contra patógenos. Segundo a professora Karina Ramalho Bortoluci, o processo é relativamente simples. Após o contato com estruturas dos patógenos ou sinais de estresse celular (alterações em organelas ou desequilíbrio iônico), as proteínas iniciadoras mudam a sua configuração permitindo a interação com a proteína adaptadora chamada ASC, que recruta a caspase-1, necessária para a maturação e secreção de duas citocinas inflamatórias bem importantes: IL-1β e IL-18, que ativam e recrutam células de defesa contra patógenos.
Na sequência, a caspase-1 cliva um terceiro substrato, que é a gasdermina D – uma molécula que, quando clivada, é capaz de se inserir e formar poros na membrana da célula, que sofre um desequilíbrio osmótico e rompe, resultando em um processo de morte programada, ou seja, a piroptose. “Na piroptose, os poros formados na membrana plasmática causam um desequilíbrio osmótico na célula, que passa a liberar na circulação moléculas sinalizadoras – as citocinas IL-1β e IL-18 – que atraem para o local um exército de glóbulos brancos. Assim, tem início uma resposta inflamatória que, em última instância, visa destruir a potencial ameaça ao organismo”, descreve a professora da Unifesp. A piroptose auxilia no controle de patógenos intracelulares, uma vez que induz à perda do nicho onde se nutre para replicar. Esse patógeno fica preso em um pedaço de membrana da célula piroptótica que é chamado PIT (pore induced trap) e, assim, está exposto para ser controlado pelas células imunes que foram atraídas ao local pelo ambiente inflamatório criado.
Na literatura, são descritos diversos tipos de inflamassomas identificados pelos seus receptores, adaptadores e estímulos específicos. A família dos NOD-like receptors (NLR), composta de NLRP1, NLRP3, NLRP6, NAIP/NLRC4, NLRP7, NLRP9b, NLRP10 e NLRP12, é caracterizada por um domínio de oligomerização e ligação de nucleotídeos (NACHT), geralmente cercado por repetições ricas em leucinas (LRRs) e domínios de recrutamento de caspase (CARD) ou de pyrin-PYD. O domínio NACHT, único comum aos membros da família NLR, permite a ativação do complexo de sinalização por meio da oligomerização dependente de adenosina trifosfato (ATP). “Apesar de os sensores NLR serem os mais estudados, o AIM2 destaca-se como o primeiro receptor não NLR a formar inflamassoma. Pertencente à família Hin-200, funciona como um sensor para DNA de cadeia dupla (dsDNA), sendo composto pela proteína AIM2, caspase-1 e proteína adaptadora ASC”, acrescenta a professora Kelly Grace Magalhães.
Estresse altera o sistema nervoso central
Os processos neuroinflamatórios têm sido associados a mecanismos de vulnerabilidade e reação ao estresse, e isso ocorre porque o sistema imunológico é sensível às tensões sofridas diariamente. Entretanto, quando intenso ou prolongado, o estresse pode provocar alterações comportamentais e neuroquímicas – a exemplo do mau funcionamento do cortisol, hormônio com ação anti-inflamatória e efeitos homeostáticos responsável pelo controle do estresse. Essa desregulação pode induzir uma resposta ainda mais intensa do sistema imune, afetando negativamente o funcionamento do sistema nervoso central e contribuindo para o desenvolvimento de transtornos psiquiátricos, como depressão e ansiedade. Os mecanismos exatos que explicam como esses eventos acontecem ainda estão em discussão, porém, várias hipóteses têm relacionado a ativação do complexo inflamassoma (presente em diversos tipos celulares, incluindo neurônios e micróglia) – especificamente do NLRP3 – a esse processo.
Uma das consequências do estresse intenso ou prolongado é o aumento da produção e liberação de moléculas de ATP que, em situações de dano celular ou tecidual, podem ser prejudiciais para a comunicação celular. Segundo a professora doutora Manuella Kaster, docente do Departamento de Bioquímica e coordenadora do Programa de Pós-graduação em Bioquímica (PPGBQA) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), estudos in vivo já demonstraram que, nos casos de estresse de contenção, poucas horas na condição de restrição são suficientes para induzir um aumento exacerbado de ATP em regiões do encéfalo de roedores e relacioná-los a problemas nas respostas emocionais e cognitivas. “O ATP é capaz de se ligar a receptores específicos que induzem uma cascata intracelular e levam à ativação do inflamassoma NLRP3 que, por sua vez, realiza a maturação de citocinas pró-inflamatórias que são liberadas e ativam a inflamação”, detalha. Estudos clínicos demonstram uma relação entre a elevação das citocinas no sangue e problemas psiquiátricos, especialmente em pacientes com doenças metabólicas que apresentam sintomas depressivos. Porém, novas evidências são necessárias para relacionar a influência do sistema imune e dos inflamassomas na fisiopatologia dos transtornos psiquiátricos como um todo.
Recentemente, a dissertação de mestrado ‘O papel da neuroinflamação nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo estresse precoce’, desenvolvida pela doutora Nicolle Platt dos Santos na UFSC, teve por objetivo compreender se um episódio de estresse psicológico somado ao de estresse físico (infecção por toxina bacteriana) durante um período crítico da vida – em que tanto o sistema nervoso central quanto o imune estão em processo de maturação –, induz o organismo a alterações comportamentais e bioquímicas imediatas ou que se refletem na idade adulta. “Verificamos que, em curto prazo, os efeitos causados pelo ‘estresse precoce’ se refletem nos comportamentos e parâmetros biológicos de um organismo em situação de doença, incluindo capacidade diminuída de locomoção e perda de peso, assim como aumento dos níveis do inflamassoma NLRP3 no hipocampo dos animais. Já em longo prazo, apesar de as respostas associadas à doença não persistirem, esses animais apresentaram problemas no comportamento emocional, além do aumento dos níveis de cortisol e do marcador de célula imune residente do encéfalo. É possível que a ativação precoce do inflamassoma NLRP3 e do sistema imune possa ter induzido respostas bioquímicas mal adaptativas”, avalia a professora Manuella Kaster, que orientou o estudo. Ao conhecer melhor os mecanismos bioquímicos associados às respostas ao estresse por meio do sistema imune será possível desenvolver estratégias mais assertivas e que impeçam ou minimizem os efeitos de transtornos psiquiátricos.
Depressão
A tese da doutora Fernanda Neutzling Kaufmann reforçou a relação entre os processos inflamatórios na patofisiologia do transtorno depressivo maior (TDM) por meio da participação da via inflamatória mediada pelo inflamassoma NLRP3 e do seu impacto em alterações neuroquímicas, por meio da via anti-inflamatória pelo imunorreceptor CD300f (proteína expressa nas células da micróglia, responsáveis pela resposta imune do sistema nervoso central) na modulação das respostas comportamentais associadas ao TDM. “Os resultados em animais demonstram que o estresse crônico imprevisível (ECI) induziu um comportamento depressivo e prejuízo de cognição, com alterações no córtex pré-frontal como diminuição dos níveis de dopamina e aumento dos níveis de noradrenalina e de IL-1β, sugerindo que o inflamassoma NLRP3 é ativado pelo estresse”, destaca a orientadora do estudo, Manuella Kaster. As análises em modelos animais possibilitaram observar a ativação das células da micróglia e da via do inflamassoma NLRP3 em diferentes regiões. Já nos estudos clínicos, a ativação do inflamassoma NLRP3 foi descrita, apenas, em células imunológicas periféricas do sangue de pacientes com depressão, podendo ser revertida pelo tratamento com antidepressivos.
Fármacos podem diminuir expressão do NLRP3
Os antidepressivos apresentam atividade anti-inflamatória que já foi demonstrada in vitro e em modelos animais. Em alguns estudos clínicos, a remissão dos sintomas após o tratamento é acompanhada pela redução plasmática de citocinas inflamatórias secretadas pela ativação do inflamassoma NLRP3. “A redução da inflamação periférica é discutida como um dos aspectos necessários para a eficácia dos antidepressivos. Contudo, os estudos clínicos apresentam resultados contraditórios, o que reflete a heterogeneidade do transtorno depressivo maior e as diferentes respostas dos pacientes aos antidepressivos”, descreve a professora Manuella Kaster. Os mecanismos associados aos efeitos anti-inflamatórios de alguns fármacos ainda não estão completamente estabelecidos. Entretanto, um artigo da pesquisadora Elísabet AlcocerGómez (e colaboradores) da Universidade de Sevilha, na Espanha, de 2017, mostrou que células imunes periféricas de pacientes com transtorno depressivo maior tratados com antidepressivos de diferentes classes apresentavam níveis reduzidos de NLRP3 e citocinas inflamatórias IL-1β e IL-18, quando comparado a pacientes com depressão não tratados.
Um fármaco hipoglicemiante que atua nos receptores de sulfonilureias do tipo 1, conhecido como glibenclamida, regula os canais de potássio sensíveis à ATP e os de cálcio presentes em tecidos musculares, células pancreáticas, neurônios, astrócitos, oligodendrócitos, tecidos endoteliais e micróglia. “O tratamento com glibenclamida é capaz de inibir os dois canais, diminuindo a ativação do inflamassoma NLRP3 e os níveis de IL-1β e IL-18”, destaca a docente Manuella Kaster. Recentemente, em colaboração com o grupo coordenado pela professora doutora Ana Lúcia Rodrigues, do Departamento de Bioquímica do Centro de Ciências Biológicas (CCB) da UFSC, foi verificado que o antidepressivo de ação rápida cetamina age sobre a via do inflamassoma NLRP3 e tem efeito protetor em modelos animais. As cientistas afirmam que a interação entre a variabilidade genética, funcionalidade da resposta inflamatória e neurotransmissão relacionadas aos pacientes com TDM pode ser fundamental para explicar a suscetibilidade diferencial ao estresse, respostas a fármacos anti-inflamatórios ou resistência ao tratamento com antidepressivos clássicos.
Mecanismo imune desencadeia a fase inflamatória da Covid
Pesquisadores da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP), liderados pelo professor doutor Dario Zamboni, docente do Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da FMRP-USP e do Centro de Pesquisas em Doenças Inflamatórias (CRID), foram os primeiros a demonstrar que os inflamassomas, especificamente o mediado pela proteína NLRP3, participam da ativação do processo inflamatório que pode causar danos em diversos órgãos em decorrência da infecção pelo vírus SARS-CoV-2. Os achados do estudo ‘Inflammasomes are activated in response to SARS-CoV-2 infection and are associated with Covid-19 severity in patients’, publicado em 2020 no Journal of Experimental Medicine, indicam potencial para aprimorar o prognóstico da doença, auxiliando na identificação precoce de pacientes de alto risco que podem evoluir para casos mais graves. A descoberta, de acordo com os cientistas, abre caminhos para testar novas possibilidades de tratamentos contra Covid-19.
O processo dos inflamassomas amplamente observado pelo grupo com outros agentes infecciosos, como a pneumonia, impulsionou os estudos para verificar se a ativação do NLPR3 nos pacientes com Covid-19 seria um dos fatores responsáveis pela evolução da doença. A pesquisa, realizada em 2020, foi dividida em três etapas. Na primeira foram analisadas células imunes (monócitos) de doadores saudáveis, infectadas com o vírus em laboratório. “Administramos na cultura uma concentração viral baixa e, após 24 horas, 75% dos monócitos morreram, indicando o potencial do vírus em induzir morte celular das células humanas”, relata o docente. A presença de lactato desidrogenase (LDH) no meio da cultura revelou que as células estavam morrendo por piroptose. Já a presença das citocinas IL-18 e IL-1β sugeriu que a morte celular estava relacionada com a ativação do NLRP3. O professor explica que, quando o inflamassoma é ativado, as proteínas que formam o complexo no citoplasma se juntam criando uma estrutura denominada ‘puncta’, que ativa a enzima caspase-1 responsável por clivar os peptídeos precursores das citocinas pró-inflamatórias, deixando as moléculas ativas.
A segunda etapa analisou amostras clínicas de 124 pacientes com quadros moderados ou graves de Covid-19, internados no Hospital de Clínicas da FMRP-USP entre abril e julho de 2020. Por meio de testes imunoenzimáticos e sondas moleculares foi possível comprovar que os glóbulos brancos dos pacientes tinham, em média, quantidade muito acentuada de IL-18 e da enzima caspase-1 em sua forma ativa. “Pelas análises constatamos que, quanto maior ativação de inflamassoma o paciente apresentava no momento de admissão hospitalar, pior era sua evolução clínica e maior a probabilidade de óbito”, ressalta o professor. Na terceira etapa foram observadas amostras de tecido pulmonar de cinco indivíduos que foram a óbito após contrair o SARS-CoV-2, obtidas durante procedimento de autópsia. As análises revelaram a presença de leucócitos infectados pelo vírus e, no interior dessas células, as punctas características do inflamassoma NLRP3. Com os achados da pesquisa e conforme os mecanismos de ativação do inflamassoma são entendidos – tanto na Covid-19 como em outros processos infecciosos –, os pesquisadores terão a possibilidade de testar novas possibilidades terapêuticas, incluindo drogas capazes de reduzir o processo inflamatório de forma mais eficiente.
Pneumonia
Uma das linhas de pesquisa do laboratório liderado do professor Dario Zamboni está relacionada às infecções pela bactéria Legionella pneumophila, causadora da pneumonia e que, segundo descoberta recente, provoca a interação entre dois inflamassomas diferentes: o AIM2 e o NLRP3. “No estudo, uma bactéria sem flagelina foi usada como modelo de agente infeccioso para estudar a interação entre esses inflamassomas. Primeiro, o inflamassoma composto pela proteína AIM2 é ativado pela presença do DNA da bactéria no macrófago que, em seguida, provoca a ruptura da membrana celular levando à saída de íons de potássio para o ambiente externo. Tal mudança é o gatilho para que o inflamassoma NLRP3 seja ativado e combata a infecção”, descreve. Apesar de envolver pesquisa básica sem apontar aplicações imediatas, os achados do artigo ‘AIM2 engages active but unprocessed caspase-1 to induce noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome’, publicado na revista Cell Reports, ajudam a compreender a resposta imune contra bactérias pulmonares.
Hiperativação do inflamassoma NLRP3 pode estar envolvida na pré-eclâmpsia
Específica da gravidez, a pré-eclâmpsia (PE) é uma doença multifatorial e multissistêmica caracterizada por quadro de hipertensão arterial e de proteinúria, que pode se manifestar a partir de 20 semanas de gestação até o puerpério. Com risco de evoluir para uma forma grave com consequências para mãe e bebê, ocorre devido a problemas no desenvolvimento dos vasos da placenta que não se vascularizam de forma perfeita, levando a uma baixa perfusão de sangue e possível isquemia e hipóxia placentária – causando descontrole da pressão arterial e possíveis danos aos rins, fígado e pulmões. Um achado recente da literatura científica apontou que gestações críticas por pré-eclâmpsia podem estar relacionadas à hiperativação do inflamassoma NLRP3 nos tecidos placentários, ocasionando um estado inflamatório sistêmico exacerbado da doença.
“A ativação da resposta inflamatória na gestação ocorre nos períodos iniciais, o que é considerado normal pois a mãe está se adaptando imunologicamente ao feto. Entretanto, nas pacientes que desenvolvem pré-eclâmpsia observa-se agravamento do estado inflamatório desencadeado principalmente pela liberação de fatores da própria placenta, o que na circulação materna pode levar a uma resposta inflamatória sistêmica com a ativação dos inflamassomas e de vias celulares importantes que agravam o quadro da doença”, descreve a doutora Priscila Rezek Nunes, pesquisadora de pós-doutorado no Instituto de Biociências de Botucatu da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) e autora da tese ‘Efeito imunomodulador da vitamina D sobre a ativação de inflamassomas em tecido placentário de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia’. A hiperativação do inflamassoma NLRP3 nos tecidos placentários pode estar envolvida no estado inflamatório sistêmico, pelo fato de esse multicomplexo ser responsável por ativar importantes vias de regulação da resposta inflamatória.
A pesquisadora Priscila Rezek Nunes avaliou 30 gestantes: 10 com PE precoce (idade gestacional <34 semanas), 10 com PE tardia (idade gestacional ≥34 semanas) e 10 normotensas. “Após o parto cesáreo, fragmentos de cerca de 10mg foram retirados da região central da placenta organizando amostras do citotrofoblasto viloso (camada de células completa abaixo da camada sincicial) e da região do sinciciotrofoblasto (principal componente da placenta, onde ocorre o transporte de nutrientes). Os explantes foram cultivados na presença ou ausência de peróxido de hidrogênio, urato monossódico, fator de necrose tumoral (TNF-α) e tratados com vitamina D”, descreve. Após 4 e 18 horas, os explantes e as células endoteliais foram submetidos à avaliação da expressão gênica e proteica de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18, TNF-α, HMGB1, tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) e vitamina D, e a apoptose nas células foi avaliada por citometria de fluxo.
Entre os achados, foi identificada uma ativação endógena de NLRP3 e NLRP1 nos explantes de gestantes com pré-eclâmpsia. “O cultivo de explantes placentários nas gestantes saudáveis e com pré-eclâmpsia foi capaz de hiperativar o inflamassoma NLRP3 e, pela primeira vez nessa situação, ativar o NLRP1. Isso indica que os estímulos atuaram como um alerta frente à ação dos inflamassomas”, explica a pesquisadora. O estudo também sugere que o tratamento in vitro de explantes placentários de mulheres portadoras de PE com vitamina D foi capaz de aliviar o quadro inflamatório e levou à inibição dos inflamassomas. Uma vez inibidos, esses complexos não seguem a sinalização para ativar vias inflamatórias importantes para o quadro sistêmico presente na pré-eclâmpsia. Os resultados corroboram outros achados da literatura que mostram o papel das citocinas inflamatórias na pré-eclâmpsia, o que poderá ser atenuado com substâncias anti-inflamatórias e antioxidantes, a exemplo da vitamina D.