A microbiota na Covid-19
Pesquisadores avaliam se o ambiente intestinal interfere na resposta imune ou na prevenção de uma reação imunológica antiviral excessiva
Desde que a pandemia de Covid-19 foi declarada, cientistas tentam identificar as características do vírus para entender de que maneira o SARS-CoV-2 age no organismo de diferentes indivíduos, e porque é tão fatal em alguns e assintomático em outros. Já se sabe que o vírus penetra na célula por endocitose, processo mediado por um receptor presente em vários tecidos, tais como pulmão, trato gastrointestinal, coração, rim, sistema nervoso e endotélio – o que explica a multiplicidade de apresentações clínicas. Mas o que os cientistas querem descobrir é se a microbiota intestinal também pode exercer um papel determinante tanto na resposta imune quanto na prevenção de uma reação imune antiviral excessiva, o que poderia ser a explicação para tantas diferenças na gravidade que caracterizam a infecção pelo SARS-CoV-2.
Muitos trabalhos têm mostrado que a microbiota está alterada e que há um quadro de disbiose em indivíduos que tiveram Covid-19, especialmente aqueles que foram hospitalizados devido a um quadro moderado a grave da doença. Essa alteração está relacionada com as sequelas que a maioria dos tratamentos ocasiona na microbiota, uma vez que o uso de antibióticos e de outros medicamentos tem grande capacidade de alterar o ambiente intestinal. “Isso é esperado, porque todos os procedimentos de terapia para Covid-19 são muito agressivos e há, sabidamente, um importante impacto na microbiota. O que não é esperado é uma alteração na microbiota de indivíduos que não desenvolveram a doença grave ou foram assintomáticos, e foi isso que encontramos como primeiro resultado do nosso estudo”, destaca a professora doutora Angélica Thomaz Vieira, coordenadora do Laboratório de Microbiota e Imunomodulação (LMI) do Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB-UFMG).
Ao avaliar amostras fecais de 128 voluntários – 64 no grupo Covid-19 e 64 no grupo controle – os pesquisadores constataram que mesmo quem teve Covid-19 leve ou moderada apresentava alterações importantes na microbiota intestinal, que afetavam a resposta imunológica pulmonar frente a infecções subsequentes, mesmo que não tenham apresentado inflamação no pulmão. O grupo coletou amostras de fezes desses voluntários 1 a 4 meses após os sintomas de Covid-19, incluindo assintomáticos ou negativos (controle), sempre da mesma família – porque o hábito alimentar e o ambiente são semelhantes. Os participantes que fizeram parte do grupo controle não apresentaram sintomas ou apresentaram PCR negativo. Também foram realizados coleta de sangue e questionário para avaliar hábitos alimentares, condições de saúde e uso de medicamentos pelos participantes. “As fezes passaram por análise de cultivo de crescimento de bactérias e não houve diferenças gritantes que caracterizassem que qualquer desses indivíduos já tivesse alguma alteração de microbiota cultivável”, ressalta a professora.
As amostras foram transferidas para animais germ free por meio de transplante fecal e, após 10 dias, a resposta inflamatória pulmonar dos animais que receberam as fezes de quem teve Covid-19 foi muito maior – se comparado às amostras dos assintomáticos. “Não vimos alterações na morfologia do intestino, mas alguma alteração que está provindo dessa microbiota está afetando diretamente o pulmão. Isso mostra que realmente tem algo na microbiota que está impactando a resposta fisiológica pulmonar de indivíduos com Covid-19”, detalha a professora. Ao fazer uma análise mais criteriosa, os pesquisadores perceberam que, embora não houvesse grandes diferenças nas enterobactérias (espécies bem caracterizadas em quadros de disbiose) presentes nas amostras fecais dos indivíduos negativos e positivos, o perfil das bactérias que estavam crescendo naqueles que tiveram Covid-19 era muito mais numeroso e havia mais morfotipos de bactérias diferentes.
A análise de antibiograma das bactérias intestinais de quem teve Covid-19 mostrou que também havia um fenótipo de resistência antimicrobiana muito maior. Segundo a professora Angélica Thomaz Vieira, outro dado interessante é que os animais que receberam as fezes de quem teve Covid-19 apresentaram perda de cognição. “Portanto, os animais tiveram inflamação pulmonar, alteração da fisiopatologia do pulmão e perda de memória, o que está totalmente associado aos efeitos pós-Covid que já estão bem descritos. Definitivamente, tem algo modulando a regulação das conexões intestino-pulmão e intestino-cérebro”, assegura. Para a pesquisadora, a principal mensagem dos dados apurados até agora é que há alterações importantes na microbiota capazes de afetar a resposta inflamatória pulmonar.
Multirresistentes
Para verificar se alterações invisíveis na microbiota que persistiram nesses indivíduos são capazes de modular aspectos histopatológicos no pulmão e se isso levaria, futuramente, a uma nova infecção, o grupo do ICB-UFMG desenvolveu outro experimento com a mesma estratégia de transferência fecal, com amostras de novos voluntários positivos e negativos para Covid-19. Após a colonização, os animais germ free foram infectados com Klebsiella pneumoniae (KPC) – uma espécie multirresistente conhecida como superbactéria – e os camundongos que receberam fezes de quem teve Covid-19 sucumbiram muito mais rápido à infecção bacteriana. “Sabemos que o antibiótico acelera e acentua essa seleção de bactérias resistentes. Mas o que me deixou mais intrigada é que o uso desses medicamentos foi muito pequeno pelos voluntários do estudo, se comparado com as alterações que encontramos com relação à multirresistência. Isso mostra que não é só o antibiótico que contribui para essas alterações, mas a doença em si”, define.
Para a professora, outra questão muito interessante é o fato de a KPC ser uma bactéria patobionte (presente normalmente na microbiota) e muito conhecida por ser potencialmente carreadora de genes de resistência. A preocupação dos pesquisadores não é saber que a Covid-19 pode favorecer o crescimento da Klebsiella pneumoniae, mas sim que poderá estimular o aumento do gene de resistência dessa bactéria. “Se percebemos que uma bactéria está crescendo, é fácil induzir uma resposta imunológica do hospedeiro e tratar. O problema é o indivíduo estar selecionando os genes mais resistentes da Klebsiella pneumoniae, o que significa que essa população estará equilibrada e estável na microbiota, no entanto, cada vez mais potente. Ainda estamos estudando quanto a KPC contribui com a Covid-19 e outras doenças”, acentua. Denominado pelos cientistas de ‘pandemia silenciosa’, o aumento de bactérias que desencadeiam genes de resistência na microbiota, como a KPC, é uma das características que alguns grupos de pesquisa estão verificando nos indivíduos que tiveram Covid-19.
Pesquisa avalia proteção da barreira intestinal
Em março de 2020 foi publicado o primeiro estudo mostrando que as células intestinais eram infectadas pelo SARS-CoV-2, e um segundo estudo de sequenciamento da microbiota indicou que indivíduos acometidos pela Covid-19 tinham modificações importantes na microbiota intestinal após a infecção. Uma dessas modificações era a diminuição das bactérias que produzem ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), moléculas produzidas por meio da fermentação de carboidratos e proteínas ingeridos pela dieta – como fibras, prebióticos e probióticos – que regulam o intestino e, principalmente, fazem a defesa do organismo. Os ácidos graxos de cadeia curta são produzidos pela microbiota intestinal e possuem um importante papel anti-inflamatório, além de serem fundamentais para a nutrição do epitélio intestinal.
Para avaliar se esses compostos poderiam participar da proteção contra a infecção provocada pelo SARS-CoV-2, pesquisadores da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) desenvolveram um estudo com uma metodologia de cultura de biópsias. As amostras de tecidos do cólon de 11 indivíduos saudáveis foram infectadas com o novo coronavírus no Laboratório de Estudos de Vírus Emergentes (Leve) da Unicamp – que tem nível 3 de biossegurança. Em seguida, os pesquisadores forneceram AGCC (acetato, propionato e butirato) diretamente nesse meio de cultura, para ver se reduzia a infecção pelo vírus. “Não conseguimos provar que esses produtos interferiam na entrada ou na replicação do vírus no intestino, no entanto, esse tratamento reduziu a expressão de um gene importante para a entrada viral nas células, assim como o receptor de citocina que favorece a inflamação”, resume a professora doutora Raquel Franco Leal, que coordenou o estudo juntamente com o professor doutor Marco Aurélio Ramirez Vinolo, do Instituto de Biologia da Unicamp.
O gene DDX58 é um receptor do sistema imune inato que detecta ácidos nucleicos virais e ativa uma cascata de sinalização que resulta na produção de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, os resultados mostraram maior expressão de interferon-beta (IFN-beta), uma molécula pró-inflamatória que participa da tempestade de citocinas característica dos casos mais graves de Covid-19. Os primeiros estudos sobre o SARS-CoV-2 já mostravam que havia alterações gastrointestinais em cerca de 50% dos pacientes no decorrer da infecção e em 17,6% dos casos graves, com sintomas como diarreia, vômito e dor abdominal. Isso decorre da quebra da barreira intestinal em razão da entrada do vírus nas células intestinais, levando a alterações em suas funções normais.
Portanto, ao melhorar a barreira intestinal, essa integridade será um fator a mais de proteção. “A quebra da barreira intestinal não é só física, mas também uma quebra molecular por falta de certos antibióticos naturais que existem na superfície do epitélio, como as defensinas. A barreira intestinal íntegra é uma das questões mais importantes para o organismo e, com certeza, faz a diferença para muitas doenças. A cada dia, os cientistas estão descobrindo mais e mais interações relacionadas ao epitélio intestinal”, acrescenta a professora Raquel Franco Leal. Segundo a docente, uma limitação do estudo foi a impossibilidade de fazer biópsias intestinais em indivíduos mais vulneráveis ou com comorbidades que, sabidamente, estão sujeitos a uma maior gravidade da Covid-19.
Dieta cetogênica pode alterar o risco
Vários trabalhos têm mostrado que a dieta cetogênica (lowcarb) é antiinflamatória para o cérebro e inibe algumas vias inflamatórias do sistema imunológico. Utilizada principalmente por pacientes diabéticos que precisam controlar a glicemia, a dieta também tem sido indicada por médicos e nutricionistas para ajudar a controlar as crises de epilepsia refratária ao tratamento em crianças. Mais recentemente, a dieta cetogênica passou a fazer parte da rotina de quem quer perder peso – neste caso, nem sempre com supervisão médica. Para investigar a influência da dieta cetogênica sobre o sistema imune do intestino, um grupo do Laboratório de Imunologia de Mucosas (LabIM) do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP) desenvolveu um experimento com camundongos e descobriu que, embora a dieta não induzisse inflamação intestinal, mudava o sistema imune e causava uma inflamação muito grande no pulmão.
“Encontramos no pulmão o recrutamento de neutrófilos e uma população de linfócitos T gama/delta que produzem interleucina-17, uma molécula que está associada à proteção contra infecções por bactérias extracelulares. No entanto, os animais estavam aparentemente saudáveis”, relata a professora doutora Denise Morais da Fonseca, coordenadora do estudo. Esses resultados foram obtidos em janeiro de 2020 e, quando começou a pandemia de Covid-19, o grupo passou a associar as constatações com os grupos de risco mais frequentes para o agravamento da doença, composto por diabéticos e obesos – justamente aqueles para os quais a dieta cetogênica é mais indicada. Assim, surgiu a hipótese de que parte do risco desses pacientes poderia vir, também, dos alimentos que consomem.
Para comprovar, os pesquisadores realizaram um primeiro experimento com um modelo de infecção em hamsters tratados com dieta cetogênica. No começo da infecção, clinicamente parecia que o animal ficaria melhor, mas, quando olharam o tecido pulmonar, estava mais inflamado e com maior carga viral. “Nesse intervalo descobrimos que esses neutrófilos vão para o pulmão, porque a dieta cetogênica muda a microbiota pulmonar. Isso é algo um pouco diferente do que estamos acostumados porque, geralmente, a dieta muda a microbiota intestinal. Não sabemos ainda como essa dieta muda a microbiota pulmonar”, detalha. Uma das hipóteses é que a dieta cetogênica pode modular diretamente a microbiota do pulmão pelos corpos cetônicos que produz, por algum metabólito que possa ativar a produção ou mesmo por interferir com o sistema imunológico pulmonar. E, quando altera o sistema imunológico do pulmão, ocorre um desbalanço na microbiota e as células inflamatórias começam a crescer.
“Foi o que aconteceu com os animais do nosso experimento: a microbiota deles começou a crescer, com mais bactérias gram-positivas que ainda estamos identificando”, afirma. O grupo quer saber se essas bactérias induzem a produção de moléculas inflamatórias, que são as citocinas, entre as quais a interleucina-6 – uma citocina inflamatória potente com uma série de funções fisiológicas, incluindo a diferenciação de linfócitos, proliferação e sobrevivência celular. A hipótese é que isso esteja associado com a Covid grave. Os pesquisadores também vão investigar os camundongos diabéticos com Covid-19 induzida para avaliar se isso está associado com a gravidade da infecção.
Inflamassoma
Segundo a professora Denise Morais da Fonseca, já está descrito na literatura científica que as dietas cetogênicas podem inibir o inflamassoma – um complexo proteico que, quando é ativado, leva a uma inflamação importante. Considerado um receptor da imunidade inata, quando o inflamassoma reconhece alterações ambientais faz uma complexa oligomerização proteica e uma ativação celular. E a resposta disso é inflamação. “O inflamassoma pode reconhecer um vírus, uma bactéria ou uma lesão tecidual. É um receptor que reconhece tanto patógenos quanto moléculas associadas a perigo ou a dano celular. Essa inibição no pulmão pode não ser boa, porque muda o equilíbrio do sistema imunológico. Um grupo de pesquisa da USP de Ribeirão Preto já mostrou que o inflamassoma é ruim para a Covid-19”, detalha.
Em paralelo, o grupo desenvolve um estudo em colaboração com pesquisadores do ICBUFMG para avaliar um questionário alimentar de indivíduos que tiveram Covid-19 e tentar correlacionar a dieta com a gravidade. “Queremos ver se quem desenvolve quadros mais graves faz uso da dieta cetogênica, o que poderia estar associado com a gravidade. Claro que não vamos propor mudar a dieta de pacientes diabéticos ou obesos, mas queremos entender qual é a consequência dessas dietas que, muitas vezes, entram na ‘moda’ e são aderidas por indivíduos saudáveis apenas para perder peso”, reforça. A docente lembra que a dieta cetogênica mudou a microbiota dos animais e, mesmo quando a alimentação foi restabelecida, a inflamação diminuiu, mas a presença dos neutrófilos no pulmão permaneceu por um longo período.
Probióticos como estratégia terapêutica
Como é consenso científico que bactérias probióticas produzem metabólitos que modulam beneficamente a resposta imunológica, o grupo da professora Angélica Thomaz Vieira testou uma cepa de Bifidobacterium longum – exclusiva da UFMG – para avaliar se era possível diminuir ou reverter o fenótipo de inflamação pulmonar nos camundongos que receberam o transplante fecal dos indivíduos que tiveram Covid-19. “Vimos que as alterações encontradas anteriormente, como perda de cognição e resposta inflamatória pulmonar, foi diminuída, o que mostra que o uso do probiótico como estratégia terapêutica de modulação da microbiota parece ter efeito importante”, acentua. Os pesquisadores ainda estão fazendo outras análises para entender um pouco melhor se o probiótico está protegendo a microbiota ou se a modulou, fazendo com que voltasse a ser um ambiente balanceado e diminuindo o número dessas bactérias resistentes. Independentemente das respostas, a professora acredita que os probióticos poderiam ser usados pelo menos como estratégia adjuvante associada a outras terapias, principalmente para os efeitos pós-Covid-19 que alguns indivíduos estão apresentando.
O grupo também fez um levantamento dos principais alimentos funcionais, probióticos e prebióticos – dentro do que é comum ser consumido pela população brasileira – e concluiu que havia uma redução do consumo desses alimentos na população que apresentou sintomas moderados de Covid-19 analisada nos estudos. “Não conseguimos verificar se há correlação direta, mas essa pode ser uma hipótese associada à gravidade da Covid e isso vai ao encontro com o que a professora Denise Morais da Fonseca está estudando”, afirma a pesquisadora do ICB-UFMG. Outro projeto paralelo do grupo visa entender as alterações da microbiota em indivíduos que mantêm dieta com baixo teor de fibras, o que pode estar associado à resistência antimicrobiana.
Enfermidade do sistema imune?
Diante das evidências científicas que estão sendo apresentadas por diferentes estudos, a professora Denise Morais da Fonseca acredita que a Covid-19 pode ser uma doença do sistema imunológico porque, em geral, quando o paciente agrava já não tem mais o SARS-CoV-2 detectável no corpo. “É como se fosse um dominó: o vírus empurra a primeira peça e começa uma cadeia inflamatória, e essas pessoas que têm doenças graves não conseguem regular a inflamação. Por isso, acho que é muito mais uma doença de perda da capacidade de regulação do sistema imunológico. A grande pergunta é por que alguns indivíduos não conseguem regular a inflamação”, questiona. A docente reforça que dificilmente se encontram trabalhos sobre a microbiota do pulmão desses pacientes, embora muitos tenham morrido de infecção bacteriana pulmonar.
Para a professora, isso ocorre porque o órgão está inflamado devido à imunidade altíssima, que está errada e não ajuda a matar o vírus ou, se elimina o vírus, leva junto tudo que está em volta. “Essa imunidade sistêmica leva a uma disfunção pulmonar, altera a função renal e já tem vários trabalhos mostrando que pode mudar até o funcionamento do cérebro, além de atacar órgãos vitais, fazer inflamação vascular e gerar problemas de coagulação. E isso tem mais a ver com essa cascata inflamatória desencadeada pelo sistema imunológico daquele indivíduo do que com a presença crônica do vírus”, acrescenta. Os pesquisadores também querem entender o que o vírus encontrou no pulmão para desencadear esse agravamento, se há um microambiente alterado, um local onde já havia células inflamatórias ou uma microbiota mais densa. No experimento com hamsters tratados com dieta cetogênica, o grupo da USP encontrou um aumento na densidade de bactérias na microbiota do pulmão dos animais e, neste caso, essa população microbiana no pulmão foi possivelmente alterada pela dieta.