Universo microscópico a ser desvendado
Sequenciamento genético possibilita identificar bactérias presentes no microbioma humano, com especial atenção ao ambiente intestinal
Estudos relacionados ao microbioma humano ganharam peso e consistência nos últimos 20 anos graças às novas ferramentas de biologia molecular e aos métodos de sequenciamento genético. Desde que o Projeto Microbioma Humano (HMP na sigla em inglês) foi criado, em 2007, muito se aprendeu sobre a diversidade e distribuição das comunidades microbianas e sobre o papel de seus genes no organismo humano. Os pesquisadores do HMP avaliaram, de 2007 a 2014, 15 locais de coleta no corpo de 300 indivíduos saudáveis (690 amostras) e identificaram mais de 10 mil espécies microbianas (95% não cultiváveis em ambiente com oxigênio). Esse universo microbiano tem um total de 3,3 milhões de genes, 150 vezes a quantidade de genes do DNA humano, que é de 22 mil. Dos 100 trilhões de microrganismos que compõem o microbioma – número 10 vezes maior que a quantidade de células humanas –, 70% estão concentrados no intestino. Esse complexo e microscópico ecossistema inclui bactérias, arqueas, vírus, bacteriófagos e microrganismos eucarióticos que interagem com o organismo e são fundamentais para manter a imunidade e a saúde.
O interesse em entender como e quanto o microbioma interfere na saúde e na doença fica ainda mais claro quando se analisa a literatura sobre o tema. No final de 2017, os investigadores do HMP publicaram mais de 650 artigos científicos que, até agora, já foram citados na literatura mais de 70 mil vezes. Somente no banco de dados PubMed, mantido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI), dos Estados Unidos, há mais de 100 mil artigos científicos sobre a microbiota e o microbioma humano, desenvolvidos por pesquisadores de várias partes do mundo. Além disso, há outros milhares de estudos abordando probióticos, prebióticos, simbióticos, psicobióticos e pós-bióticos, inclusive as novas espécies descobertas e identificadas a partir do Projeto Microbioma Humano. As pesquisas vão muito além de demonstrar a importância do microbioma para o sistema gastrointestinal e investigam como esses microrganismos podem influenciar em doenças cardiovasculares, metabólicas e autoimunes, alergias, doença inflamatória intestinal, câncer, gravidez e saúde feminina, pediatria e neonatologia, transtornos mentais e neurológicos – como o transtorno do espectro autista – e doenças neurodegenerativas, a exemplo de Parkinson e Alzheimer, entre muitas outras.
“Nos últimos 20 anos testemunhamos um avanço imenso no que diz respeito à compreensão do microbioma humano devido aos métodos de sequenciamento genético da microbiota, seja por meio do gene 16S rRNA ou do sequenciamento de varredura (shotgun) que, ao lado de ferramentas de metagenômica, permitiram entender e identificar a microbiota de praticamente todos os órgãos e segmentos do corpo humano. Com isso, entendemos que a microbiota é individualizada e que cada área do nosso organismo tem uma específica, porque esse universo de microrganismos pode depender de fatores como a tensão de oxigênio, o pH e os nutrientes disponíveis na área do seu habitat”, detalha o médico Dan Waitzberg, professor doutor associado do Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) e diretor do GANEP Nutrição Humana e do Bioma4me. Os cientistas também conseguiram identificar que aproximadamente 1,2 mil espécies bacterianas habitam o intestino, no entanto, menos da metade é conhecida em termos de taxonomia e função. Atualmente, há um esforço muito grande para sequenciar essas novas bactérias a fim de identificá-las e entender qual é seu papel na saúde e na doença.
Para isso, os grupos de pesquisa estão comparando as sequências de DNA das novas bactérias com as sequências daquelas já conhecidas na tentativa de agrupá-las em espécies e filos. “Uma vez que se agrupou e conhece o DNA dessas novas bactérias poderá ser possível, por meio de técnicas sofisticadas, injetar plasmídeos e fazer com que produzam substâncias. Pode ser que, dentro de alguns anos, a taxonomia deixe de ser clássica – família, gênero e espécie – para ser uma taxonomia de vias metabólicas e, se isso acontecer, vai mudar muito toda a concepção do conhecimento da microbiota que se tem hoje”, argumenta o professor Dan Waitzberg. Outra novidade é a descoberta de que uma bactéria benéfica, perante condições adversas, pode se tornar agressiva, porque esses microrganismos têm quorum sensing, um sistema de comunicação intra e interespécies que reflete o seu comportamento, demonstrando a capacidade de habitar ambientes diversos, captar informações desse meio, comunicar-se com diferentes espécies, monitorar sua densidade populacional e, principalmente, regular a expressão gênica, controlando processos celulares como esporulação, formação de biofilmes, expressão de fatores de virulência, produção de bacteriocinas, antibióticos e bioluminescência. O docente cita, como exemplo, um ambiente de UTI no qual, em 12 horas, a microbiota intestinal de um paciente pode se transformar completamente e, por estar perante uma situação adversa, ficar agressiva porque quer sobreviver.
A professora doutora Katia Sivieri, do Departamento de Alimentos e Nutrição da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) – campus Araraquara, acrescenta que também houve uma evolução expressiva em termos de ferramentas de análise e na quantidade de material a ser analisado. “Hoje, temos ferramentas superpoderosas de sequenciamento genético dos microrganismos, mas ainda nos faltam mais ferramentas de análise de bioinformática para decifrar e entender todo esse conhecimento que está em nossas mãos. Essa tarefa demanda a formação de mais profissionais de bioestatística, bioinformática e metagenômica, que serão fundamentais para a análise desses dados”, afirma a pesquisadora, que estuda os probióticos e a microbiota intestinal desde 2003 e 2010, respectivamente. Frente a esse desvendamento da microbiota e à descoberta de novos microrganismos surgem outros conhecimentos e, agora, a Ciência passa a falar também em paraprobióticos (células microbianas não viáveis que, quando administradas em quantidades adequadas, conferem benefício ao hospedeiro) – também conhecidos como probióticos fantasmas; pós-bióticos e em uma nova geração de probióticos. Enquanto os probióticos são células viáveis que têm um efeito importante na microbiota, os pós-bióticos são metabólitos ou até mesmo soluções intracelulares dessas bactérias, que são liberadas após o rompimento da parede celular. “A nova geração de probióticos, que é a palavra do futuro, são esses microrganismos isolados da nossa própria microbiota que ainda não são comerciais e têm novas funções relacionadas à prevenção de vários tipos de patologias. Acredito muito nesses novos probióticos”, ressalta a professora Katia Sivieri.
DESCOBERTAS
Um dos destaques mais recentes é a Akkermansia muciniphila, uma bactéria anaeróbia gram-negativa que reside no revestimento intestinal e utiliza a mucina, presente no muco intestinal, como fonte de energia. Os estudos têm mostrado que a Akkermansia muciniphila está envolvida no controle do perfil glicídico e lipídico. Em 2016, o grupo da professora Katia Sivieri desenvolveu um estudo in vitro com suco de laranja pasteurizado que mostrou um efeito prebiótico para a microbiota intestinal. Para confirmar o achado, os pesquisadores realizaram um ensaio clínico randomizado e controlado com suco de laranja pasteurizado envolvendo 10 voluntárias, que ficaram 30 dias seguindo um cardápio saudável – com restrições de não ingerir probióticos, prebióticos, bebidas alcoólicas e chocolate. Depois disso, mantiveram a dieta por mais 60 dias com a ingestão de 300ml de suco de laranja pasteurizado e, após esse período, continuaram sendo acompanhadas por mais 30 dias. O trabalho mostrou que o suco de laranja integral e sem adição de açúcar aumentou a abundância de Akkermansia muciniphila que, por sua vez, teve uma correlação negativa com os marcadores bioquímicos de glicose, insulina, LDL-colesterol e triglicérides. O estudo foi publicado no início de 2020 na Food & Functional, da Royal Society of Chemistry.
O professor Dan Waitzberg ressalta que, embora seja considerada potencialmente um excelente probiótico, a Akkermansia tem uma grande sensibilidade ao oxigênio e, por isso, os cientistas ainda não estão conseguindo trabalhar com essa bactéria de forma comercial. No entanto, alguns pesquisadores franceses tiveram a ideia de usar a Akkermansia inativada e obtiveram vários efeitos benéficos como pós-biótico, um ramo que está em forte movimento no mundo. Além da Akkermansia muciniphila, outras várias espécies têm sido identificadas, a exemplo de novas espécies de Bacteroides, como o B. ovatus e o B. dorei. A professora Katia Sivieri conta que uma descoberta interessante diz respeito ao Bacteroides fragilis, que é bem conhecido como produtor de enterotoxinas – que agem no intestino causando principalmente dores abdominais, diarreias e vômitos. “Alguns Bacteroides da espécie fragilis, mas de outras cepas isoladas da microbiota, não têm esse gene produtor de enterotoxina e, pelo contrário, produzem polissacarídeos com ação probiótica. A síntese desses polissacarídeos está relacionada ao controle de alguns tipos de inflamação, principalmente no intestino. É a mesma espécie, só que a cepa tem uma característica completamente diferente da que já conhecemos”, acentua.
ÓRGÃO VIRTUAL
Outro avanço importante foi o entendimento de que os genes da microbiota interagem com os genes humanos por meio de mecanismos epigenéticos que controlam as modificações nas expressões gênicas. Assim, além de os genes interagirem, as substâncias que essas bactérias produzem têm uma ação sobre a expressão gênica por meio da metilação e da modificação de histonas (mecanismos epigenéticos desse processo). O professor Dan Waitzberg afirma que esse conhecimento é bastante novo e vai modificar substancialmente a abordagem terapêutica durante alterações da microbiota, por exemplo, ao se utilizar probióticos que poderão produzir as moléculas contrárias à ação dos microrganismos patobiontes ou até trabalhar em conjunto com a microbiota já existente, beneficiando-se de comunidades do tipo clusters. “Se atrás de cada gene microbiano tem uma molécula, uma proteína ou uma enzima, significa que há um ‘órgão virtual’ dentro do intestino, que produz milhares de substâncias e moléculas que interagem com o organismo. Se essa microbiota tem microrganismos comensais e simbiontes em equilíbrio com os patobiontes teremos um estado de eubiose e, portanto, benefícios à saúde, seja em termos estruturais de membrana da barreira da mucosa intestinal, em termos imunológicos ou de proteção contra patógenos”, argumenta. Além disso, esses microrganismos produzem substratos importantes para a saúde, como vitamina B12, ácido fólico, vitamina K e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), entre outros. Durante situações adversas como alimentação inadequada, tabagismo, alcoolismo, uso de drogas, antibióticos, imunossupressores, medicamentos antidepressivos e condições de doença, a microbiota intestinal pode mudar e entrar em um estado de disbiose, que significa uma modificação na riqueza, diversidade e composição, com prevalência de patobiontes e redução de microrganismos simbiontes e comensais.
Benefícios dependem da capacidade metabólica da cepa
A microbiota intestinal é única como uma impressão digital, formada até os três anos de idade e alterada de acordo com estilo de vida, uso de medicamentos, álcool, drogas e envelhecimento, entre outros fatores. Os estudos desenvolvidos ao longo das últimas décadas mostraram que o uso de probióticos e prebióticos pode alterar essa microbiota temporariamente de forma positiva, ajudando a prevenir uma série de problemas. Com a evolução das ferramentas de análise também foi possível compreender que os benefícios conferidos pelos microrganismos probióticos têm uma relação cepa-dependente, e que há uma diferença no microbioma de grupos de indivíduos de um país ou até mesmo de um clima específico. Como as pesquisas têm mostrado que os efeitos benéficos para determinadas enfermidades dependem da cepa, uma das grandes dificuldades é identificar como um determinado probiótico vai interferir ou alterar essa microbiota tão específica, porque os benefícios vão depender da capacidade metabólica da cepa e se consegue interferir no metabolismo do ser humano para promover um efeito benéfico.
A professora titular Susana Saad, chefe do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP e que estuda os probióticos há 20 anos, a firma que o grande desafio é entender qual mudança a cepa vai promover na microbiota, por ser muito difícil detectar. “Em razão de não ser possível identificar o perfil ideal de microbiota para cada indivíduo, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e a Agência Europeia de Medicamentos (EMA na sigla em inglês) retiraram da definição de probiótico a informação de que ‘auxilia no equilíbrio da microbiota intestinal’. Esse também é o motivo de, atualmente, serem exigidos estudos clínicos para avaliar se o probiótico tem algum efeito no hospedeiro, com número razoável de indivíduos, duplo-cego e controlado por placebo”, detalha. Isso porque a microbiota ideal pode ter uma especificidade para cada pessoa e não se sabe ainda qual é o perfil ideal.
Para a docente, apesar de as técnicas de biologia molecular possibilitarem destrinchar o microbioma e identificar novas espécies até então desconhecidas, ainda predominam cepas específicas dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium como as principais bactérias probióticas nativas do intestino humano comprovadamente benéficas à saúde e que têm a tendência de beneficiar a microbiota intestinal. Um dos estudos coordenados pela professora, em colaboração com uma pesquisadora da Universidade de Illinois de Chicago (UIC), nos Estados Unidos, envolve o Lactobacillus rhamnosus GG para estimular os receptores de vitamina D, um pró-hormônio que, associado ao paratormônio (PTH), atua como importante regulador do metabolismo ósseo. Como cada indivíduo responde diferentemente à suplementação de vitamina D – que para ser sintetizada precisa do sol – e muitas pessoas não se expõem ao sol sem proteção, há um número cada vez maior de indivíduos com carência dessa vitamina.
“Parece que isso está relacionado com o receptor de vitamina D, que alguns indivíduos talvez não tenham e, por isso, não respondem a essa suplementação. Minha aluna desenvolveu um leite fermentado com o probiótico Lactobacillus rhamnosus GG e percebeu que, nos animais, houve um estímulo desse receptor de vitamina D. Os animais que tinham esse receptor também melhoravam a inflamação, porque a vitamina D tem potencial anti-inflamatório. Esse pode ser um caminho interessante do uso da cepa no futuro”, resume. O grupo da professora Susana Saad também desenvolve estudos sobre a produção de folato e riboflavina (vitaminas do complexo B) por bactérias láticas probióticas e não probióticas, resultando no bioenriquecimento de alimentos fermentados como alternativa à suplementação química com vitaminas; e sobre a influência da suplementação da dieta materna e da ingestão de prebióticos na microbiota do leite humano para a modulação da saúde materna e infantil.
MASSIFICAÇÃO
Há 20 anos, os cientistas que estudavam a microbiota observavam os filos, como Bacteroidetes e Firmicutes, e correlacionavam com as doenças. Com o passar dos anos, começaram a estudar as famílias de microrganismos, que também é muito grande; depois o gênero e, em seguida, passaram a observar as espécies. Agora, os pesquisadores estão procurando, em meio a essa abundância de novas informações e de novos microrganismos, qual é a assinatura dessa microbiota para as diferentes enfermidades. “Pacientes com diabetes tipo 2, por exemplo, têm baixa abundância de Akkermansia muciniphila, portanto, aí pode estar a assinatura da doença. Essa baixa abundância de Akkermansia indica que essa microbiota está em disbiose e, provavelmente, uma reposição dessa espécie poderia melhorar o quadro do diabetes”, argumenta a professora Katia Sivieri, da UNESP.
Embora a microbiota intestinal esteja envolvida com uma série de enfermidades, a docente adverte que está havendo uma massificação de informação sobre probióticos e, por isso, alguns profissionais estão estimulando o consumo na tentativa de controlar algumas doenças, sem saber se aquela cepa realmente poderá ajudar. Assim, acabam prescrevendo o mesmo probiótico para tudo: da diarreia a pacientes em tratamento de câncer, de colite a ansiedade. “As pessoas começam a ingerir esses probióticos e acabam não vendo o efeito, claro, porque a resposta no organismo é cepa-dependente. Sabemos que as cepas conhecidas ajudam na saúde intestinal, mas não sabemos se podem auxiliar em outras patologias. Estamos tão focados na microbiota nos últimos anos que achamos que toda explicação está no intestino, mas não! Às vezes, o componente é absorvido antes de chegar ao ambiente intestinal”, enfatiza.
Imunidade de mucosas e mais resistência a enfermidades
Todas as mucosas do corpo humano estão envolvidas com a imunidade – oral, conjuntiva, gastrointestinal, urogenital –, pois existe um tráfego de células e moléculas entre elas por meio da circulação. Desde a década de 1970, estudos já demonstravam que a secreção das mucosas tem grande quantidade de mediadores e anticorpos e, nos últimos anos, os cientistas comprovaram que a mais importante é a mucosa do intestino. Com 200 a 300m2, a mucosa intestinal é a maior superfície de contato do organismo humano com o mundo externo. Devido a essa abundância de células linfoides em contato direto com o lúmen intestinal, o intestino é reconhecido como o maior órgão linfoide do corpo, o que é extremamente importante para o sistema imune. Além disso, há um enorme aporte de antígenos da dieta que entra diariamente no intestino, nem sempre degradados ou picotados em aminoácidos, assim como proteínas com atividade antigênica e outros componentes da dieta para os quais os linfócitos, por exemplo, têm receptores.
Entender qual o efeito da estimulação do sistema imune por antígenos naturais da microbiota e da dieta é o grande interesse dos pesquisadores do Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB -UFMG) – um dos poucos grupos no Brasil que trabalha com imunologia de mucosas, desde os anos 1980. “Há 25 anos, a imunologia de mucosas era um assunto muito marginal na Imunologia e não estava nem nos livros textos. Hoje, é um dos tópicos que mais crescem devido às novas técnicas de sequenciamento genético que levaram a um boom nos estudos, mostrando quanto a microbiota intestinal é importante na doença e em vários aspectos da saúde”, afirma a professora doutora Ana Maria Caetano Faria, que coordena os estudos na área no ICB-UFMG. As novas técnicas de sequenciamento genético do microbioma também tornaram possível uma análise com precisão da composição da microbiota humana.
Um dos trabalhos na área foi desenvolvido na UFMG pelo pesquisador Daniel Mucida que, hoje, é docente na Rockfeller University, em Nova Iorque. O estudo mostrou como a microbiota influenciava o desenvolvimento do sistema imune e foi feito com camundongos germ-free que, quando atingiam a idade adulta, tinham um sistema imune subdesenvolvido, como o dos recém-nascidos. Em outro estudo, a pesquisadora Jucilene Menezes demonstrou que, ao serem alimentados desde o desmame até a vida adulta com uma dieta sem proteína (que é um antígeno para o sistema imune) e aminoácidos, esses animais ficavam nutridos, porém, sem a fonte antigênica também teriam um subdesenvolvimento do sistema imune. O grupo da UFMG continua trabalhando com a dieta sem proteínas para comprovar que o animal fica com o sistema imune bastante imaturo, o que dificulta a resposta a patógenos.
Outros estudos mostram o efeito da vitamina A para o sistema imune, pois é importante na diferenciação de células reguladoras; da vitamina D, que tem um papel anti-inflamatório muito importante, inclusive com receptor nas células imunológicas; e dos ácidos graxos de cadeia curta, como lipídios, ômega 3 e ácido linoleico conjugado, que ativam receptores nas células imunes. A vitamina D está sendo utilizada, inclusive, como tratamento complementar da Covid-19, uma vez que o SARS-CoV-2 causa um quadro inflamatório como resposta à reação imunológica. A professora Ana Maria Caetano Faria também coordena um estudo com idosos de Belo Horizonte que tiveram Covid-19 assintomática, inclusive centenários, para entender se a microbiota intestinal conferiu proteção imunológica contra a doença. Em 2019, a aluna Maria Cecília Campos Canesso ganhou o prêmio CAPES de tese com um trabalho que comprovava a estimulação da microbiota intestinal por algumas bactérias capazes de produzir dinucleotídeos cíclicos, um tipo especial de DNA. “O estudo mostrou que o receptor era a molécula STING (stimulator of interferon genes) nas células, e a estimulação via STING ajuda a promover esse tônus imunológico para tornar o sistema imune maduro, tanto na mucosa quanto sistemicamente. Continuamos interessados em entender qual é o papel da dieta na microbiota e como a mudança microbiana influencia o sistema imune”, conta a docente.
DIVISÃO
Um trabalho coordenado pelo pesquisador Daniel Mucida e publicado na Nature constatou que o intestino é dividido em porções (jejuno, íleo e cólon) imunologicamente e anatomicamente muito diferentes, assim como os linfonodos que drenam essas regiões, por isso, promovem respostas imunes distintas e até antagônicas. A microbiota compreende o trato gastrointestinal que vai da boca ao ânus, mas há uma gradiente no intestino que vai aumentando na porção distal, e é no cólon e no intestino grosso que está concentrada a grande parte da microbiota – embora o intestino delgado também tenha bactérias muito específicas. “Hoje, sabemos que algumas bactérias colonizam especificamente porções diferentes do intestino. As bactérias láticas, uma boa parte usada como probióticos, por exemplo, podem ser comensais e se concentram basicamente no intestino delgado, na região mais proximal”, detalha a docente da UFMG, que também estuda o viroma, porque alguns vírus que habitam a microbiota são comensais.
Modulação da microbiota nas doenças inflamatórias crônicas
Na tentativa de descobrir se os probióticos poderiam ajudar a modular a microbiota e melhorar algumas doenças in amatórias crônicas, como as doenças autoimunes e alérgicas, a professora Ana Maria Caetano Faria desenvolve estudos em parceria com os professores Vasco Azevedo e Anderson Miyoshi, do Departamento de Genética da UFMG. O grupo trabalha especialmente com a cepa Lactococcus lactis que, embora não esteja presente na microbiota indígena, é uma bactéria lática muito utilizada na indústria alimentícia. Considerada segura, a cepa fica aproximadamente 48 horas no intestino e produz efeitos importantes ao alterar a composição microbiana e aumentar a abundância de bactérias láticas, que têm grande capacidade anti-inflamatória. Os docentes desenvolveram um Lactococcus lactis recombinante que produz a chamada ‘proteína de choque térmico’ (HSP65), que promove uma resposta ao estresse celular muito expressa durante eventos inflamatórios e torna a célula tolerante a agressões posteriores.
Vários trabalhos foram publicados desde 2013 mostrando que esse probiótico recombinante que produz a proteína de choque térmico é capaz de prevenir várias doenças autoimunes, como esclerose múltipla, artrite reumatoide e retocolite ulcerativa. “Temos testado uma bactéria chamada NCDO 2118, que é da UFMG, mas podemos eventualmente suplementar com outras, até mesmo leveduras. Acreditamos que é interessante fazer uma associação de bactérias e leveduras para obter um efeito simbiótico, para que essas bactérias trabalhem juntas com o microbioma normal”, argumenta o professor Vasco Azevedo. Um dos trabalhos visa melhorar os sintomas da mucosite oral e intestinal, uma inflamação intensa e muito desabilitante que ocorre em pacientes que fazem quimioterapia. O grupo está testando a cepa em animais com mucosite e a intenção é iniciar, em breve, os ensaios clínicos para desenvolver um alimento com probiótico com essa cepa. Segundo o pesquisador, se administrada até 10 dias antes da quimioterapia, a bactéria probiótica pode levar a uma modificação na microbiota com um efeito anti-inflamatório duradouro, diminuindo o aparecimento da mucosite.
O grupo também está testando os paraprobióticos, células microbianas não viáveis ou frações de células microbianas que podem ter o efeito probiótico, pois produzem ácido lático ao chegar ao intestino. Além disso, os cientistas estão fazendo um estudo de coorte com idosos em Belo Horizonte, em colaboração com o Hospital das Clínicas da UFMG e com a equipe dos professores Edgar Morais e Rodrigo Santos, que coordenam o Laboratório de Envelhecimento Saudável. A ideia é fazer uma correlação entre o envelhecimento saudável e as modificações que acontecem com a microbiota ao longo da vida, mostrando como é a microbiota de um idoso frágil em comparação à de um idoso saudável, especialmente aqueles com mais de 100 anos. “Há um universo enorme para ser descoberto a respeito do microbioma intestinal, o que deverá ser um marco para a Medicina do futuro”, avalia o professor Vasco Azevedo.