Benefícios para a saúde infantil
Estudo estabelece o perfil da microbiota intestinal de crianças japonesas em idades pré-escolar e escolar
Chongxin Wang1, Satoru Nagata1,2, Takashi Asahara3, Norikatsu Yuki 3, Kazunori Matsuda3, Hirokazu Tsuji3, Takuya Takahashi1,2, Koji Nomoto1,3, Yuichiro Yamashiro1
A microbiota intestinal típica de um adulto pode pesar 1kg ou mais, e é composta por 1014 microrganismos, cerca de 10 vezes mais do que o número total de células do corpo humano. Estes microrganismos intestinais contribuem significativamente não só para a nutrição e o metabolismo, mas também para a regulação da angiogênese do intestino, proteção contra patógenos e desenvolvimento das funções imunes. O microbioma intestinal passa por mudanças durante os diferentes estágios da vida, com a mais dramática alteração durante a infância.
Os probióticos são microrganismos vivos que exercem propriedades benéficas no hospedeiro, devido à sua influência no equilíbrio do balanço e do ambiente intestinal. Assim, devem ser resistentes ao suco gástrico, à bile e às enzimas proteolíticas, permitindo que cheguem vivos ao intestino. Lá, estimulam a modificação da microbiota e contribuem para a redução dos riscos de doenças. Os probióticos atuam no reparo da composição da microbiota (disbiose) e no restabelecimento da sua resiliência. Há cerca de 20 anos cresce o interesse pela manipulação da microbiota intestinal por meio de probióticos, para prevenção e tratamento de algumas doenças. Entretanto, análises da microbiota intestinal em crianças em idade pré-escolar e escolar e efeitos da suplementação de probióticos sobre a microbiota destas crianças ainda são pouco publicados.
Neste contexto, o presente estudo foi desenhado para estabelecer um perfil de base da microbiota intestinal de crianças e a suplementação com probióticos. Investigamos mais especificamente os efeitos da ingestão diária de leite fermentado contendo Lactobacillus casei Shirota (LcS) na microbiota fecal e intestinal de crianças japonesas saudáveis em idades pré-escolar e escolar, antes, durante e após seis meses da suspensão da ingestão do produto. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Hospital da Universidade de Juntendo e foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki.
O estudo envolveu 23 crianças saudáveis (14 meninos e 9 meninas, idade média de 7,7 ± 2,4 anos – na faixa de 4 a 12 anos), IMC 19,6 ± 4,6, selecionadas com base no histórico de saúde (sem ocorrências de tratamentos com antibióticos, inflamações crônicas, viroses, alergias, participações em outros projetos de pesquisa). A composição e o perfil da microbiota intestinal das crianças se apresentou semelhante àquela encontrada em adultos saudáveis. A dieta teste consistiu de um leite fermentado disponível no mercado (Yakult 400, Yakult Honsha Co. Ltd., Tóquio, Japão) contendo 4 x 1010 colônias de LcS (YIT 9029) por frasco de 80ml.
O leite fermentado continha glicose/frutose/açúcar líquido, leite desnatado e aromas. A dieta foi oferecida na quantidade de um frasco de 80ml contendo 1,0g de proteína, 0,1g de gordura, 14,4g de carboidratos e 15mg de sódio e 4 x 1010 de colônias de LcS vivos. A dieta teste foi providenciada pela Yakult Honsha. A pesquisa foi conduzida como um estudo aberto, avaliando os parâmetros antes, durante e após a ingestão. Os participantes foram esclarecidos a suspender o consumo de quaisquer produtos lácteos que contivessem LcS ou outras bactérias láticas no mínimo três semanas antes do início dos estudos. Após este período, os participantes foram orientados a consumir diariamente um frasco de leite fermentado com LcS durante seis meses, entre janeiro e julho de 2012.
Métodos de análise – As amostras de fezes foram obtidas das crianças no dia 1 (antes da ingestão), nos meses 1, 3 e 6 do período de ingestão e após seis meses da suspensão. A cada tempo, para cada criança, cerca de 1g de amostra de fezes foi coletada separadamente em tubos estéreis de coleta contendo solução RNA estabilizante (para análise da microbiota fecal), e em tubos estéreis vazios (para análise de ácidos orgânicos). Os tubos foram armazenados a 4°C (para análise da microbiota fecal) ou a -20°C (para análise de ácidos orgânicos) por aproximadamente 36 horas. As amostras de fezes foram mantidas em caixas térmicas refrigeradas e enviadas imediatamente para o Instituto Central Yakult.
Para determinar a concentração da bactéria presente em determinada amostra, cada amostra de RNA extraída foi submetida a uma diluição de 10 séries em nuclease anidra; as diluições foram submetidas a RT–qPCR. Os valores do ciclo de quantificação no âmbito linear da análise foram aplicados na curva padrão, gerada no mesmo experimento, para obter a contagem de colônias de bactérias em cada amostra de ácido nucleico, e os resultados convertidos em colônia de bactérias por amostra. O procedimento foi realizado em triplicata para cada amostra de RNA.
O método usado para a detecção de Clostridium difficile e Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), S. aureus meticilina resistentes à coagulase negativa (MRCNS), S. aureus sensíveis à meticilina (MSSA) e S. aureus sensíveis à meticilina coagulase negativas (MSCNS) foi descrito anteriormente (Wada, M. e col. – Quantitative reverse transcription – PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Appl Microbiol 2010; 108:779 – 788). A quantificação de LcS foi descrita previamente (Fujimoto, J. e col. – Identification and quantification of Lactobacillus casei strain Shirota in human feces with strain specific primers derived from randomly amplified polymorphic DNA. Int J Food Microbiol 2008; 126:210 – 215). O limite mais baixo de detecção do LcS foi 5,7 x 1010 colônias/g de fezes.
Ácidos orgânicos e pH – A concentração de ácidos orgânicos nas amostras foi medida através de HPLC (Waters 432, com detector de condutividade, Waters, EUA) e coluna Shodex RSpack KC-811 (Showa Denko, Tóquio). Calculamos a concentração de ácidos orgânicos em espécies experimentais baseados na curva padrão. A curva padrão foi gerada usando solução padrão misto de ácido succínico, ácido lático, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido isobutírico, ácido butírico, ácido isovalérico e ácido valérico de 1 – 20 mM. O pH de cada espécie experimental foi medido pela inserção direta do eletrodo de vidro do pHmetro D-51 (Horiba Seisakusho Co., Ltd., Tóquio) em uma amostra homogeneizada.
Análise estatística – Os resultados das etapas pré, durante e após a ingestão foram comparados usando o teste não paramétrico de Wilcoxon (microbiota e ácidos orgânicos fecais) e teste paramétrico pareado t (pH fecal). A taxa de detecção das bactérias foi analisada por meio do teste de probabilidade exata de Fisher. Usamos o programa IBM SPSS Statistic Desktop versão 22.0 (IBM Japan Ltd., Tóquio, Japão). Em todos os testes foi estabelecido o valor p ˂ 0,05 para reconhecimento da significância. As concentrações de ácidos orgânicos fecais e pH das crianças saudáveis mantiveram-se estáveis e comparáveis às obtidas em pesquisas anteriores.
Não houve diferença significativa entre as amostras de fezes analisadas durante o período de estudo. A quantidade de Bifidobacterium aumentou significativamente nos meses 3 e 6 do período de ingestão, quando comparado com os níveis de pré-ingestão (p ˂ 0,05 e p ˂ 0,01, respectivamente). A contagem de Lactobacillus totais aumentou significativamente nos meses 1, 3 e 6 do período de ingestão, quando comparada à da pré-ingestão (p ˂ 0,01). Entretanto, nos seis meses após a ingestão, as contagens de Bifidobacterium e de Lactobacillus voltaram aos níveis da linha de base e não diferiram significativamente dos valores da fase de pré-ingestão.
Não foi detectado nenhum LcS em quaisquer amostras fecais no período pré-ingestão, enquanto que no período de ingestão os LcS chegaram a cerca de 107 colônias/g em todas as amostras fecais e voltaram abaixo dos limites de detecção após seis meses da suspensão da ingestão do leite fermentado. As contagens de Enterobacteriaceae e Staphylococcus diminuíram significativamente nos meses 3 e 6 do período de ingestão, comparado com os níveis da pré-ingestão (Enterobacteriaceae p ˂ 0,01 para ambos os tempos, Staphylococcus p ˂ 0,01 e p ˂ 0,05, respectivamente). Entretanto, os níveis dos grupos retornaram aos valores estatisticamente indistinguíveis da linha de base durante o período pós-ingestão. Nem MRSA ou MRCNS foram detectados nas amostras.
Houve diminuição significativa nos níveis de C. perfringens após a ingestão do leite fermentado com LcS durante seis meses (p ˂ 0,05). Entretanto, assim como os níveis de contagem de outras bactérias, os C. perfringens voltaram aos níveis estatisticamente indistinguíveis entre os períodos pré-ingestão e pós seis meses da suspensão do leite fermentado. As concentrações totais de ácidos orgânicos e ácido acético aumentaram significativamente nos terceiro e sexto meses de ingestão do leite fermentado contendo LcS, comparados com o período da pré-ingestão (p ˂ 0,01), e retornaram aos valores de base após seis meses da suspensão do consumo. Uma queda significativa no pH fecal também foi observada após seis meses da ingestão do probiótico (p ˂ 0,05), e retornou ao nível básico após a suspensão. Uma correlação reversa foi encontrada nos seguintes parâmetros em 98 amostras de fezes que foram analisadas: populações de Bifidobacterium e Enterobacteriaceae, concentração de ácido acético, e concentração de ácido acético e pH. Em contraste, uma correlação positiva foi observada entre a população de Bifidobacterium e a concentração de ácido acético.
Discussão envolve microbiota a partir do nascimento
A microbiota intestinal é parte integrante da fisiologia humana, e a disbiose está relacionada a muitas condições de doença. No momento do nascimento, o bebê deixa um ambiente intrauterino livre de bactérias (embora alguns estudos sobre o microbioma placentário desafiem este paradigma) e entra em contato com um universo externo altamente contaminado. Em poucas horas após o nascimento ocorre a colonização do intestino, processo influenciado por vários fatores, como gestação, duração e alimentação da mãe, além de condições ambientais, genética e saúde materna. Tivemos a oportunidade de estudar a dinâmica das alterações da microbiota intestinal de 166 bebês saudáveis desde o primeiro dia do nascimento até os três anos de idade, incluindo a demonstração de que uma ampla variedade de anaeróbios estritos colonizou o intestino dos recém-nascidos após o nascimento. A maioria desses bebês, especialmente aqueles amamentados com leite materno, apresentou uma microbiota dominada por Bifidobacterium em três meses.
A microbiota continua a evoluir, exibindo um alto grau de instabilidade, fica estável e atinge padrões definitivos semelhantes aos dos adultos somente aos 2 a 3 anos. Este processo pode ser influenciado por fatores ambientais e qualidade de vida, como hábitos alimentares, higiene, infecções, medicamentos e outros. Segundo alguns estudos, a microbiota intestinal de crianças de 2 a 5 anos de idade já é relativamente estável e muito parecida com a de adultos. Os nossos resultados do perfil da microbiota intestinal de crianças de 4 a 5 anos foram coerentes com as publicações anteriores.
Um perfil saudável da microbiota intestinal nos primeiros meses está relacionado à saúde durante a vida, enquanto que uma composição anormal está associada com o aumento do risco de desenvolvimento de problemas sistêmicos, como obesidade e suas doenças correlacionadas, incluindo diabetes tipo 2 e enfermidades alérgicas, como asma e estados de inflamação do intestino. Baseado na origem do desenvolvimento da saúde, doença e epigenética, crianças nascidas prematuras e pequenas para a idade gestacional são predestinadas a correr riscos altos de síndrome metabólica e obesidade, incluindo diabetes tipo 2 e doenças cardiovasculares.
A maioria dessas crianças nasce de cesarianas (por diversos motivos) e sofre de disbioses. A disbiose intestinal não é um fator de risco significativo, tais como sepse e enterocolite necrosante em recém-nascidos, mas contribui para os riscos de obesidade e síndrome metabólica na vida futura. As alterações benéficas induzidas na microbiota fecal e no ambiente intestinal observadas após a ingestão do probiótico sugerem que a suplementação pode ser utilizada para melhorar a disbiose em bebês prematuros e abaixo do peso ideal.
O Bifidobacterium, um dos gêneros presentes na microbiota intestinal, é reconhecidamente benéfico à saúde. Diversos estudos demonstram as vantagens do ácido acético produzido pelo Bifidobacterium. O consumo de longo prazo do LcS aumenta a população de Bifidobacterium indígeno, bem como a concentração do acetato fecal. No presente estudo foram observadas uma correlação positiva entre a população de Bifidobacterium e a concentração de ácido acético em crianças sadias, e uma correlação negativa entre a concentração de ácido acético e a população de Enterobacteriaceae.
O ácido acético, um dos metabólitos mais produzidos pelo Bifidobacterium, possui comprovadamente forte atividade bactericida in vitro contra bactérias Gram-negativas. Baseados nos resultados observados, podemos sugerir que a ingestão do probiótico induz ao aumento da concentração do ácido acético e à diminuição concomitante do pH intestinal. Juntos, estes fatores podem ser responsáveis pela supressão de bactérias nocivas, como Enterobacteriaceae, Staphylococcus e Clostridium perfringens. Utilizamos o leite fermentado com LcS como probiótico pelos efeitos benéficos sobre a saúde solidamente comprovados, bem como a segurança clínica e eficácia em bebês e idosos, além do seu longo histórico de consumo por japoneses e populações de países onde é comercializado. Nenhum efeito adverso foi observado durante a pesquisa. Este é o primeiro estudo realizado para demonstrar os efeitos benéficos da suplementação do probiótico na promoção de uma composição favorável da microbiota em crianças sadias em idades pré-escolar e escolar.
Estes resultados darão sustentação para futuras investigações na avaliação dos efeitos do consumo de longo prazo na regulação da homeostase da microbiota intestinal e também para observar os efeitos na predisposição a diversas doenças na vida futura. Os resultados sugerem que o consumo de produtos contendo probióticos modificou favoravelmente a composição da microbiota intestinal. Notavelmente, este efeito terminou em seis meses após a interrupção do consumo, indicando que o LcS não habitava permanentemente o trato intestinal das crianças e desaparecia definitivamente neste período. Estas observações sugerem que o consumo regular de probióticos pode ser benéfico para a manutenção da saúde intestinal infantil e pode refletir na saúde no futuro. O estudo foi publicado no Annuals of Nutrition & Metabolism 2015, 67: 257 – 266.