LcS e a diversidade da microbiota
Consumo diário de probióticos pode aliviar respostas associadas ao estresse psicológico, fisiológico e físico
Akito Kato-Kataoka, Kouji Miyazaki, Mai Takada, Mitsuhisa Kawai, Hiroko Kikuchi-Hayakawa, Kazunori Suda, Hiroshi Ishikawa, Yusuke Gondo, Kensuke Shimizu, Takahiro Matsuki, Akira Kushiro, Instituto Central Yakult, Kunitachi, Tóquio; Kensei Nishida, Yuki Kuwano, Kazuhito Rokutan, Departamento de Fisiopatologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de Tokushima, Kuramoto, Tokushima; Ryoutaro Hoshi, Osamu Watanabe, Tomoki Igarashi, Departamento de Desenvolvimento, Yakult Honsha, Higashi-Shimbashi, Minato, Tóquio, Japão
A microbiota intestinal, um ecossistema diverso e dinâmico que gera interligação entre o intestino e o hospedeiro, pode se comunicar através da modulação intestino-cérebro, que é um sistema de comunicação bidirecional neuro-humoral entre os dois órgãos. Sinais do cérebro modificam as modalidades motoras, sensoriais e secretoras do trato gastrointestinal e, por sua vez, sinais do intestino podem afetar o comportamento emocional e os sistemas de modulação do estresse e da dor por meio de caminhos neurais, endócrinos e imunes. Assim, o eixo intestino-cérebro foi agora expandido para microbiota-intestino-cérebro. É particularmente interessante considerar a possibilidade de que os probióticos, que são microrganismos vivos, podem afetar a emoção na saúde e na doença, modulando o eixo microbiota-intestino-cérebro, e conferir benefícios para a saúde. Estudos em animais demonstraram que a administração de probióticos mantém a função da barreira da mucosa em situações estressantes e atenua as respostas dos glicocorticoides induzidos pelo estresse e das citocinas inflamatórias em associação com a redução da depressão e ansiedade.
Os probióticos também reduzem a expressão do receptor mRNA do ácido gama-aminobutírico (GABA) e c-Fos no cérebro, possivelmente modulando o eixo intestino-cérebro por meio das vias vagais. Ensaios clínicos demonstraram que os probióticos têm efeitos benéficos aliviando o sofrimento psicológico em indivíduos saudáveis e normalizando o número de células Natural Killer (NK) reduzidas pelo estresse e por sintomas gastrointestinais. Um modelo de estresse de curta duração, como um exame acadêmico, tem sido empregado frequentemente para examinar respostas ao estresse psicológico. Este modelo também foi usado para avaliar a alteração da microbiota intestinal associada ao estresse e os efeitos de prebióticos ou probióticos na disfunção gastrointestinal e/ou nas infecções do trato respiratório superior.
O L. casei Shirota é um probiótico bem conhecido e que foi reconhecido como seguro pela Food and Drug Administration, dos Estados Unidos. O probiótico é sugerido para proporcionar benefícios à saúde, equilibrando a microbiota intestinal, melhorando a disfunção gastrointestinal, prevenindo a infecção e o câncer e modulando respostas inflamatórias e imunes. Estudos anteriores demonstraram que o L. casei Shirota melhora distúrbios de humor em idosos e diminui sintomas de ansiedade em pacientes com síndrome da fadiga crônica e, em um experimento piloto, suprimiu o aparecimento de sintomas físicos em estudantes de medicina saudáveis expostos ao estresse acadêmico. No entanto, não foi completamente examinado se o L. casei Shirota alivia as respostas induzidas pelo estresse psicológico associado ao eixo microbiota-intestino-cérebro de indivíduos saudáveis.
O estudo clínico ‘Leite fermentado contendo Lactobacillus casei Shirota protege a diversidade da microbiota intestinal e alivia disfunção abdominal em estudantes de medicina saudáveis sob estresse acadêmico’, duplo-cego, placebo controlado e em grupo paralelo, foi conduzido para examinar o efeito de um leite fermentado contendo L. casei Shirota na disfunção abdominal induzida pelo estresse como parâmetro primário, bem como em estado psicofísico, marcadores salivares de estresse, alterações da expressão gênica em leucócitos periféricos e do sequenciamento de genes amplicons 16S rRNA da microbiota intestinal em estudantes de medicina saudáveis que realizaram um exame nacional para a promoção acadêmica. As amostras incluíram leites fermentados contendo L. casei Shirota YIT 9029, obtidos do Laboratório de Pesquisa de Coleção de Culturas do Laboratório de Pesquisas do Instituto Central Yakult (Kunitachi, Tóquio, Japão), e placebo contendo leite não fermentado com o mesmo conteúdo nutricional, cor, sabor e pH. As amostras foram distribuídas e armazenadas entre 0ºC e 10ºC. O leite fermentado com L. casei Shirota continha Lactobacillus casei Shirota em mais de 1,0 x1011 UFC por frasco de 100ml durante a intervenção.
Participantes
Este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes estabelecidas na Declaração de Helsinque e todos os procedimentos envolvendo humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário da Universidade de Tokushima, em Tokushima, Japão. Os 54 estudantes do 4o ano de medicina da Universidade de Tokushima realizaram um exame nacional para o avanço acadêmico, que envolve todos os estudantes do curso básico e medicina clínica. No Japão, a aprovação do exame é necessária para a promoção de nível (5o ano). Este exame realizado on line em um único dia é um dos mais estressantes para todos os estudantes japoneses de medicina. Dos 54 alunos recrutados, cinco foram excluídos com base nos critérios: idade > 30 anos, fumo, consumo de medicamento por três meses antes da inclusão, doença mental e/ou outras doenças, ou alergias ao leite ou a outros alimentos.
Assim, 49 estudantes (27 do sexo masculino e 22 do sexo feminino) participaram do experimento. Um frasco de 100ml de leite fermentado contendo L. casei Shirota ou placebo foi consumido diariamente durante oito semanas até o dia anterior ao exame. O consumo foi registrado em um diário para verificar a taxa de conformidade. O estudo foi composto por um período de pré-intervenção de duas semanas, intervenção de oito semanas e pós-intervenção (período pós-exame) de duas semanas. Durante o estudo, todos cumpriram as restrições alimentares para evitar o consumo de outros leites fermentados, iogurte, bebidas contendo bactérias láticas e produtos com probióticos ou prebióticos. Medicamentos e visitas hospitalares foram permitidos e registrados em um diário. O estudo foi inscrito no registro de ensaios clínicos sob o número UMIN000011926 e conduzido de outubro/2013 a janeiro/2014.
Disfunção abdominal e parâmetros psicológicos
Os participantes responderam um questionário para avaliar cinco sintomas abdominais: desconforto abdominal e dor, sensação de evacuação incompleta, distensão abdominal, esforço durante o movimento intestinal e dor gástrica, com pontuação para cada sintoma em todas as semanas do experimento. A cada duas semanas, a pontuação total de disfunção abdominal, que foi a soma de cada ponto, e a pontuação de cada sintoma também foi analisada para cada indivíduo, como um subdesfecho da disfunção abdominal. A disfunção gastrointestinal foi avaliada utilizando a versão japonesa da escala de avaliação de sintomas gastrointestinais (GSRS), mostrando que pontuações mais altas indicam sintomas mais graves. A pontuação total e cinco subescalas da GSRS – síndrome de refluxo ácido, síndrome de dor abdominal, síndrome de indigestão, síndrome de diarreia e síndrome de constipação – foram analisadas a cada duas semanas durante o período experimental.
Os voluntários responderam a versão japonesa do Questionário de Ansiedade Estado/Traço (STAI – State-Trait Anxiety Inventory) para avaliar níveis, estado e traço de ansiedade durante o período experimental, e a versão japonesa do NEO Five-Factor Inventory (NEO-FFI), para avaliar cinco traços de personalidade (neuroticismo, extroversão, abertura a novas experiências, amabilidade e consciencialidade) no momento da triagem. Os estados de estresse foram pesquisados usando escala analógica visual, com uma sensação intolerável a cada duas semanas durante o período experimental. O estilo de vida foi avaliado no momento da triagem e a saúde foi avaliada por meio da versão japonesa do Questionário Geral de Saúde-28 (GHQ-28) durante o período experimental. Além disso, os participantes responderam à pergunta: “Você acha que consumiu a amostra ativa ou o placebo?”.
Cortisol e alfa-amilase
A saliva dos participantes foi coletada durante dois minutos entre 16h e 17h para evitar flutuações diurnas, usando um dispositivo de amostragem antes da coleta de amostras do sangue. Após o armazenamento das amostras a -80°C, os níveis de cortisol na saliva e a atividade da alfa-amilase foram analisados por meio de uma enzima do kit de análise imunossorbente.
Células NK no sangue
O sangue venoso periférico foi coletado entre 16h e 17h após a coleta de saliva. A atividade das células NK foi analisada e o número de células NK (CD3- CD16+ CD56+) nas células mononucleares do sangue periférico foi determinado por ensaio de liberação de cromo utilizando 51Cr-labeled K562 como célula alvo e por citometria de fluxo, respectivamente.
- casei Shirota viáveis
O número de colônias viáveis de Lactobacillus casei Shirota em UFC por grama de fezes, coletadas oito semanas antes (pré-intervenção), duas semanas antes, três a um dias antes e duas semanas após o exame foram determinados pelo método de cultura usando um meio de cultura agar de lactitol-LBS-vancomicina (LLV). A cepa foi identificada por PCR de colônia, usando um conjunto de iniciadores específicos para o Lactobacillus casei Shirota.
Resultados indicam benefícios dos probióticos
Neste estudo, nos concentramos na disfunção abdominal induzida pelo estresse como desfecho primário. Além disso, examinamos se a administração de L. casei Shirota afetou os perfis de expressão gênica em leucócitos periféricos e como modificou as alterações induzidas pelo estresse na composição da microbiota intestinal. O estudo demonstrou que o consumo diário de L. casei Shirota reduziu significativamente a disfunção abdominal, o VAS medindo sensação de estresse, alterações da expressão gênica e o índice de diversidade alfa da microbiota intestinal preservado, em comparação com o grupo controle. No grupo placebo, a pontuação estado STAI, o VAS que mede a sensação de estresse e o nível de cortisol na saliva aumentaram em pico um dia antes do exame. De acordo com estudos anteriores consistentes, os parâmetros de estresse psicológico e fisiológico observados neste estudo também apoiam a observação de que os estudantes apresentam respostas máximas ao estresse no dia anterior ao exame, demonstrando a validade do modelo de estresse atual.
O GSRS é amplamente utilizado para avaliar sintomas da síndrome do intestino irritável e dispepsia funcional, ambos agravados em condições estressantes. De fato, o estresse de curta duração está diretamente relacionado ao início de sintomas de disfunção gastrointestinal. Subanálise dos itens de disfunção abdominal e do GSRS mostraram que as pontuações de desconforto e dor abdominal no primeiro, bem como para indigestão e diarreia no último, aumentaram de uma a duas semanas antes do exame no grupo placebo. O consumo diário de L. casei Shirota resultou em uma tendência para a melhora do desconforto e da dor abdominal, conforme avaliado pela pontuação de disfunção abdominal, assim como melhora significativa da indigestão, conforme avaliado pela pontuação GSRS. Além disso, a análise estratificada do desconforto e da dor abdominal revelou que o consumo diário de L. casei Shirota não só impediu seu início em participantes sem sintomas, mas também melhorou o desconforto e a dor abdominal nos participantes que já se queixavam desses sintomas durante o período de pré-intervenção. O aumento do nível de cortisol salivar também foi suprimido no grupo L. casei Shirota neste estudo. Portanto, a ação direta do LcS sobre as respostas ao estresse pode estar envolvida no alívio da disfunção gastrointestinal em estudantes de medicina saudáveis expostos ao estresse acadêmico.
O sistema serotonérgico pode ser um dos ‘nós’ potenciais na regulação do eixo intestino-cérebro. Foi relatado, recentemente, que a microbiota intestinal influencia o metabolismo do triptofano e a biossíntese de serotonina. Além disso, a análise da sequência de gene amplicon 16S rRNA da microbiota intestinal mostrou que os pacientes com síndrome do intestino irritável tiveram uma reduzida diversidade na microbiota intestinal e maiores porcentagens de Bacteroidetes no nível de filo da microbiota na mucosa intestinal, inferior em comparação com os controles saudáveis, e que o tratamento com probiótico aumentou a porcentagem para um nível de controle saudável. Além disso, a microbiota intestinal de pacientes com depressão mostrou maiores porcentagens de Bacteroidaceae e menores porcentagens de Lachnospiraceae no nível familiar, em comparação com os controles saudáveis. Com base nestes achados, examinamos os efeitos do LcS na microbiota intestinal por meio da análise da sequência de amplicons do gene 16S rRNA e descobrimos que a porcentagem de Bacteroidetes no nível do filo tende a aumentar antes do exame apenas no grupo placebo. O consumo diário de LcS reduziu significativamente a porcentagem de Bacteroidaceae em nível familiar, e as alterações induzidas na Bacteroidaceae podem estar associadas à melhora da disfunção abdominal.
O estudo também revelou que o número de espécies da microbiota, observado como uma medida do índice de diversidade alfa, foi significativamente maior no grupo L. casei Shirota em relação ao placebo, antes do exame, mas era semelhante entre os grupos antes da intervenção. Um relatório recente demonstrou que o tratamento com probiótico aumenta o índice de Shannon em indivíduos saudáveis. Análises adicionais no presente estudo demonstraram que o consumo de LcS suprimiu não só o início da disfunção abdominal, mas também a diminuição do índice de Shannon do estresse do exame acadêmico em comparação ao consumo de um placebo. No entanto, esses efeitos foram observados nos 23 indivíduos que estavam sem sintomas durante o período de pré-intervenção, mas não nos 24 que já se queixavam de sintomas abdominais naquele momento. Portanto, é possível especular que o início da disfunção abdominal pode estar associado com a diminuição da diversidade alfa da microbiota intestinal em adultos saudáveis e sem sintomas abdominais. Assim, o índice de diversidade alfa pode ser um marcador potencial para a associação entre microbiota intestinal e alterações fisiológicas, não apenas em pacientes com síndrome do intestino irritável, mas também em jovens saudáveis expostos a breves estressores naturais.
Análise do estresse psicológico
Também avaliamos a resposta ao estresse de uma maneira diferente, medindo as mudanças dependentes do tempo na expressão gênica em leucócitos periféricos usando um arranjo do genoma humano inteiro. Os níveis de expressão de aproximadamente 100 genes mudaram em duas vezes no grupo LcS e placebo, em comparação com aqueles medidos duas semanas antes do exame. No grupo placebo, o número de genes com respostas ao estresse aumentou para 179, enquanto que o consumo diário de L. casei Shirota quase preveniu completamente as mudanças adicionais na expressão dos genes. A análise da via dos 179 genes em resposta ao estresse mostrou que o exame acadêmico afetou preferencialmente um grupo de genes relacionados ao metabolismo lipídico (por exemplo, ERCC2, FGF1, PPARGC1A, RARA, SREBF1). Curiosamente, nosso estudo anterior revelou que o L. casei Shirota atenuou o metabolismo lipídico através da supressão da atividade do nervo simpático. A administração de LcS preveniu mudanças adicionais nos níveis de expressão dos genes, incluindo as dos genes relacionados ao metabolismo lipídico (ERCC2, FGF1, PPARGC1A). Esses resultados sugerem que a administração de LcS pode suprimir a resposta ao estresse sistêmico quando confrontado com estresse acadêmico, o que pode estar associado à redução da sensação de estresse pelo VAS e disfunção abdominal.
A atividade das células NK também é conhecida por ser alterada pelo estresse psicológico agudo e reduzida pelo aumento dos níveis de cortisol. No presente estudo, a atividade das células NK foi mantida em um nível relativamente alto durante o período pré-exame, mas foi reduzida imediatamente após o exame nos dois grupos. Embora não houvesse diferença significativa na atividade das células NK entre os grupos, o consumo de L. casei Shirota preveniu uma redução significativa da atividade das células NK imediatamente após o exame e o declínio significativo do número de células NK duas semanas antes e duas semanas após o exame, todos observados no grupo placebo. Foi demonstrado que o L. casei Shirota recupera a atividade das células NK em indivíduos com baixa atividade dessas células. Portanto, é possível especular que o consumo diário de L. casei Shirota possa preservar a função das células NK em situações estressantes.
A principal limitação deste estudo foi a falta do poder estatístico devido ao número pequeno de participantes. Cerca de 100 alunos em cada escola de medicina no Japão estão desafiando o exame de progresso acadêmico todos os anos, e aproximadamente metade é cooperativa. Portanto, estudos adicionais com um número maior de participantes, como análise conjunta baseada em ensaios repetidos, são necessários para esclarecer o efeito do LcS na disfunção abdominal induzida pelo estresse, alterações das atividades das células NK e microbiota intestinal e associações entre estes efeitos. Além disso, devido às interações complexas existentes entre probióticos e hospedeiro, os mecanismos completos de ação do L. casei Shirota permanecem desconhecidos. Mais estudos são necessários para estabelecer os efeitos de alívio do estresse do LcS. Concluímos que o consumo diário de probióticos, como o Lactobacillus casei Shirota, preserva a diversidade da microbiota intestinal e pode aliviar as respostas associadas ao estresse psicológico, fisiológico e físico, prevenindo o aparecimento de disfunção abdominal e mantendo a qualidade de vida em indivíduos saudáveis expostos a breves estressores naturais. O estudo foi publicado no Applied and Environmental Microbiology (2016). doi: 10.1128/AEM.04134-15.