L. casei Shirota e soja contra o câncer de mama
O câncer de mama é uma das doenças mais comuns entre as mulheres e sua incidência está associada à taxa de mortalidade mais crescente da humanidade. Em particular, a prevalência nos países asiáticos, que era baixa no passado, tem aumentado rapidamente nos últimos anos. Uma das principais razões seria a mudança dos tradicionais hábitos alimentares asiáticos para a dieta ocidental, e a diminuição na prática das atividades físicas. Um grande número de estudos epidemiológicos mostra que o consumo diário de fitoquímicos pode prevenir o câncer de mama. Em especial, as isoflavonas da soja têm sido largamente estudadas e o consumo habitual de alimentos de soja, como o extrato, tem reduzido comprovadamente os riscos do câncer de mama. O mecanismo responsável para a prevenção do câncer de mama através das isoflavonas de soja, especialmente a genisteína, envolve atividade fitoestrogênica, a inibição da tirosina quinase oncogênica e antiangiogênica, antioxidante e anti-inflamatória. A prevenção de câncer de mama através das isoflavonas de soja tem sido revista nos padrões de conduta da Sociedade Americana de Câncer.
Probióticos são definidos como microrganismos vivos benéficos ao organismo do hospedeiro. Algumas espécies de probióticos são relatadas em prevenir câncer em modelos animais através de vários mecanismos de ação, tais como a modulação do sistema imune e/ou a geração de metabólitos biologicamente ativos no intestino. Os probióticos Lactobacillus casei Shirota (LcS YIT 9029) são reconhecidos por prevenir o câncer. Nos estudos em animais, a administração de LcS retardou a carcinogênese induzida quimicamente em diversos modelos. Em humanos, os LcS preveniram o câncer de bexiga e suprimiram o desenvolvimento do câncer colorretal. Um dos mecanismos presumidos para a prevenção do câncer através dos LcS aconteceria através do aumento das atividades imunológicas, tais como a das células Natural Killer (NK), para induzir os efeitos citotóxicos contra as células tumorais por meio do estímulo da produção de várias citoquinas. Além disso, por meio da modificação da microbiota intestinal, os LcS podem aumentar a produção de substâncias úteis à homeostase do cólon e reduzir o aumento das substâncias mutagênicas derivadas dos alimentos ingeridos.
Para investigar os efeitos do consumo de isoflavonas de soja e L. casei Shirota na ocorrência de câncer de mama, foi realizado um estudo caso-controlado envolvendo 316 pacientes com câncer de mama e 662 controles. Este estudo apontou que a quantidade de isoflavonas de soja consumida habitualmente, como também de LcS desde a infância, estava intimamente associada à redução do risco do câncer de mama, e o consumo simultâneo desses produtos era especialmente mais eficiente. Os cientistas ainda não tinham esclarecido se o consumo conjunto das isoflavonas de soja e L. casei Shirota seria mais eficiente para a prevenção do câncer de mama do que a ingestão de cada componente isolado.
O presente estudo, publicado on line na Revista Cancer Science (volume 104, n° 11, páginas 1508 a 1514, novembro de 2013), contribuiu para investigar os efeitos preventivos do extrato de soja, do L. casei Shirota e a sua combinação contra o desenvolvimento e crescimento dos tumores mamários. Além disso, ajudou a esclarecer os mecanismos através de um modelo de tumor induzido quimicamente em modelos animais. Camundongos Sprague-Dawley fêmeas receberam dietas AIN-76ª com altas concentrações de gorduras, extrato de soja, Lactobacillus casei Shirota, extrato de soja + LcS ou dieta normal, e com administração oral de 2-amino-1-metil-6 fenilimidazol [4,5-b] piridina, durante oito vezes em doses de 85mg/kg de peso corpóreo em um período de duas semanas.
O desenvolvimento de tumores mamários palpáveis foi monitorado por 17 semanas. Os tecidos tumorais foram imunohistoquimicamente examinados por meio dos receptores (ER)-a, Ki-67 e CD34. As incidências e as multiplicidades dos tumores mamários, em comparação com o grupo controle, foram menores no grupo com o extrato de soja e no grupo com extrato de soja + Lactobacillus casei Shirota, enquanto que o volume do tumor diminuiu com o LcS isolado e com o LcS + extrato de soja. A análise imunohistoquímica revelou que o extrato de soja combinado ao Lactobacillus casei Shirota reduziu mais efetivamente a quantidade de células ER-a positivas e Ki-67 positivas nos tumores do que o extrato de soja isolado e que o LcS, assim como o extrato de soja, diminuiu a angiogênese do tumor. Estes resultados demonstram que o extrato de soja impede o desenvolvimento dos tumores mamários e que o Lactobacillus casei Shirota detém o crescimento do tumor, aumentando as propriedades do extrato de soja. O consumo habitual dos Lactobacillus casei Shirota, em combinação com o extrato de soja, pode fazer parte de uma dieta benéfica à prevenção do câncer de mama.
Materiais e métodos
O extrato de soja adquirido da Shikokukakoki (Tokushima, Japão) foi liofilizado, transformando-se em extrato de soja em pó. O Lactobacillus casei Shirota, obtido da Yakult Honsha Co. Ltd. (Tóquio, Japão) foi cultivado em meio de cultura Lactobacillus MRS (Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, EUA) e liofilizado posteriormente para obtenção do LcS em pó. Todo o protocolo experimental in vivo foi aprovado pelo Comitê de Facility Animal. Camundongos Sprague-Dawley fêmeas de quatro semanas (CLEA Japan, Tóquio, Japão) foram mantidos em gaiolas individuais em sala com ar condicionado com ciclos de iluminação de 12 horas luz/escuro. Os camundongos tiveram livre acesso à dieta com alto teor de gordura modificada AIN-76ª (CLEA Japan) e água esterilizada. Conforme protocolo de um estudo prévio, após uma semana de aclimatação os camundongos foram randomicamente separados em quatro grupos de 42 animais e um grupo veículo de 15. A dieta dos camundongos foi alterada para uma dieta experimental com alto teor de gordura adicionada de extrato de soja, LcS, extrato de soja + LcS, ou nenhum dos dois. As quantidades de extrato de soja e de LcS em pó foram determinadas em estudos anteriores e a composição nutricional de cada uma das dietas experimentais foi ajustada para ter a mesma quantidade de calorias da dieta controle.
Cada dieta experimental foi renovada semanalmente, armazenada a 4ºC, para garantir o consumo das isoflavonas e dos Lactobacillus casei Shirota ativos. A estabilidade das isoflavonas da dieta foi confirmada através de análises de cromatografia líquida com espectrometria de massa. O comportamento dos camundongos foi monitorado diariamente e seus pesos registrados uma vez por semana durante o período de estudo. Uma semana após o início das dietas experimentais, o carcinógeno químico 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo [4,5-b] piridina (Ph1P, Nard Institute Ltd., Osaka, Japão) foi dissolvido em água ultrapura e administrado por meio de tubos gástricos em doses de 85mg/kg de peso, quatro vezes por semana durante duas semanas. O preparado foi administrado igualmente nos animais do grupo veículo. O desenvolvimento de tumores mamários foi detectado por meio de apalpamento. O comprimento, a largura e a altura de cada tumor foram medidos com paquímetros e o volume do tumor foi calculado por meio da fórmula Volume do tumor = (comprimento) x (largura) x (altura) x p/6.
Na 17ª semana, os camundongos foram anestesiados com éter e sacrificados após jejum de 17 horas. O sangue foi coletado da aorta em tubos contendo EDTA-2K para preparar o plasma. As concentrações de glicose, colesterol livre e total, e triglicérides no plasma foram dosadas por meio do sistema Accute TBA-40FR (Toshiba Medical Systems, Tochigi, Japão), seguindo o manual do fabricante. Todas as glândulas mamárias foram removidas e transferidas imediatamente em solução de 10% de formalina tamponada e coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para análise histopatológica e diagnóstico de tumores mamários.
Análise estatística
Todos os dados foram expressos como a média ± erro padrão (SE). A incidência de tumor foi analisada através do teste X². A multiplicidade dos tumores, volume e diâmetro de cada grupo experimental foram analisados usando o teste t de Welch relativo ao grupo controle e a multiplicidade foi ajustada usando o teste de permutação. A média das pontuações do Ki-67 LI foi analisada usando o teste de Wilcoxon. Outros dados foram analisados utilizando o ANOVA de uma via seguido do teste Dunnett. O valor de P < 0,05 foi estabelecido como estatisticamente significativo. As alterações decorrentes do tempo da multiplicidade e diâmetro foram compensadas por um espaçamento de tempo, no período de desenvolvimento dos tumores individuais, usando um modelo misto com camundongos com interceptação aleatória para estimar as alterações decorrentes da multiplicidade dos tumores e seus diâmetros. Um SE empírico foi utilizado para cada coeficiente. Os termos de interação para o extrato de soja e Lactobacillus casei Shirota foram conduzidos através do desenho fatorial 2 x 2 e foram anexados ao modelo misto. Entretanto, como os termos de interação não foram significativos, um novo exame foi realizado usando o modelo misto sem os termos de interação. Estas análises foram realizadas por uma organização de pesquisa em estatística (Statcom Co. Ltda, Tóquio, Japão).
desenvolvimento e crescimento dos tumores
Uma das vantagens do modelo quimicamente induzido está em imitar o processo de alteração das células do estado normal para o câncer; entretanto, o período que antecede a formação do tumor é diferente para cada tumor individualmente. Assim, a compensação no período individual de formação do tumor foi realizada para analisar precisamente o desenvolvimento do mesmo. O tempo para o desenvolvimento do tumor foi definido a partir da primeira semana usando a escala de compensação de tempo e a alteração do diâmetro do tumor, ao longo do tempo, e calculado até a oitava semana. O desenvolvimento do tumor foi significativamente suprimido nos grupos Lactobacillus casei Shirota e extrato de soja + LcS após a quinta semana.
As avaliações posteriores do efeito da administração do extrato de soja e Lactobacillus casei Shirota sobre o desenvolvimento e crescimento de tumores e suas interações, as alterações na multiplicidade dos tumores e os diâmetros ao longo do tempo do experimento foram analisados usando um modelo estatístico misto. As alterações da multiplicidade foram anexadas ao modelo estatístico e, depois, os efeitos do extrato de soja e L. casei Shirota sobre a velocidade do aumento da multiplicidade foram estimados. As interrupções e taxas de mudanças nas interações entre o extrato de soja e L. casei Shirota não foram significativas. A taxa de aumento da multiplicidade foi de 0,135 tumores/camundongo por semana no grupo com o extrato de soja, comparada aos 0,309 tumores/camundongo por semana no grupo sem o extrato de soja, demonstrando que a administração do extrato de soja inibiu o desenvolvimento do tumor (P < 0,001).
A análise das alterações nos diâmetros dos tumores ao longo do período da experiência, interrupção e taxas de mudanças nas interações não foi estatisticamente significativa. A taxa de aumento do diâmetro do tumor foi de 0,957 mm/tumor por semana no grupo com Lactobacillus casei Shirota, comparada com 1,457 mm/tumor por semana na ausência de LcS, demonstrando que a administração da cepa inibiu significativamente o desenvolvimento do tumor (P = 0,003). “Estas observações esclareceram os diferentes modos de evitar os tumores mamários, isto é, o extrato de soja inibiu o desenvolvimento e o Lactobacillus casei Shirota suprimiu o crescimento”, afirmam os cientistas.
Inibição da angiogênese
A angiogênese tumoral é fundamental no crescimento do tumor e na metástase. Para avaliar os efeitos dos produtos testados sobre o MVD como um índice de angiogênese, vasos expressores de CD34 nos tumores foram imunohistoquimicamente examinados. Comparados com o grupo controle, o MVD foi significativamente inferior em todos os grupos (grupos extrato de soja e LcS, P < 0,01; extrato de soja + LcS P = 0,017) sugerindo que a administração tanto do extrato de soja quanto do Lactobacillus casei Shirota inibiram a angiogênese tumoral.
Análise histoquímica
Secções de tumores tratadas com 0,3% de peróxido em metanol para bloquear a peroxidase endógena, imunocordado, respectivamente, com o anticorpo monoclonal de camundongo receptor antiestrógeno (ER)-a (Daco Japan, Tóquio, Japão), anticorpo monoclonal de coelho anti-Ki-67 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EUA) ou anticorpo policlonal de cabra CD34 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). As secções foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado e etiquetadas como anticorpos biotinilados com estreptavidina (Histofine Simple Stain MAX PO kit, Nichirei Bioscience, Tóquio, Japão), de acordo com as instruções do fabricante. As secções foram visualizadas com diaminobenzidina, contrastadas com hematoxilina e capturadas usando um BX51 (Olympus, Tóquio, Japão). As células expressadas com ER-a e Ki-67 foram contadas para calcular a proporção média da população de células entre 500 células tumorais (cinco campos representativos não sobrepostos x 100 células). Cada tumor foi classificado de acordo com a proporção de células expressoras de ER-a ou índice de marcação por Ki-67 (LI). A densidade dos microvasos em cada tumor foi definida através do número significativo de vasos expressores de CD34 por campo.
Resultados indicam inibição da carcinogênese mamária
As alterações nos hábitos alimentares são importantes na prevenção do câncer de mama e estudos prévios de casos controlados demonstraram que o consumo habitual de isoflavonas de soja e de probióticos, especialmente L. casei Shirota, concomitantemente, diminuem os riscos para a doença. Para esclarecer o mecanismo básico, o presente estudo investigou a eficiência do extrato de soja e Lactobacillus casei Shirota utilizando o indutor químico PhIP de câncer de mama em modelos animais alimentados com uma dieta com alto teor de gorduras. A administração de extrato de soja inibiu o desenvolvimento dos tumores mamários, enquanto a ingestão de LcS suprimiu o crescimento do tumor. Além disso, a administração de LcS, em combinação com extrato de soja, apresentou eficácia preventiva tanto para a multiplicidade quanto para o volume dos tumores. As descobertas indicam que os L. casei Shirota e o extrato de soja agem em diferentes fases do processo de carcinogênese para auxiliar na prevenção.
A obesidade tem sido relacionada como fator de risco para câncer de mama, e a prevenção da obesidade, por meio da melhor ingestão de lípides e glicose, acarreta na diminuição dos riscos. A obesidade foi induzida nos camundongos em início de carcinogênese. Nos grupos que consumiram extrato de soja e extrato de soja + LcS, os níveis de colesterol livre e total, triglicérides e glicose no plasma foram significativamente menores do que no grupo controle, acompanhados da supressão de ganho de peso. As isoflavonas e proteínas de soja são reconhecidas pelas ações benéficas no metabolismo dos lípides e da glicose, e esses efeitos acarretaram na prevenção da obesidade neste estudo. Isoflavonas, saponinas e peptídeos da soja possuem potencial para a expressão do gene cyp1A1 e ugt1A1, proteínas que podem eliminar vários carcinógenos, como o Ph1P. Por consequência, o efeito preventivo do extrato de soja sobre o desenvolvimento do tumor, neste estudo, pode ser devido a esses componentes, que agem sinergicamente com as isoflavonas.
Já foi relatado que os L. casei Shirota aumentam a atividade imunopotencializadora do hospedeiro. Em camundongos portadores de tumor, a esplenomegalia foi causada por hematopoeses extramedulares e também pelo acúmulo de células supressoras derivadas do mieloide (MDSC), induzindo um estado imunossupressivo. A inibição do acúmulo de MDSC pela administração de agentes anticancerígenos e fitoquímicos é efetiva na terapia e prevenção do câncer. Neste estudo, a taxa de neutrófilos e de monócitos na fração de leucócitos aumentou significativamente nos grupos administrados com LcS, em comparação ao controle, sugerindo que o LcS poderia atuar sobre o sistema imune.
A ação imunomoduladora do L. casei Shirota durante o processo de carcinogênese é conhecida através de pesquisas anteriormente publicadas, portanto, o Lactobacillus casei Shirota pode restaurar o estado imunossupressor sob o processo carcinogênico, suprimindo assim o crescimento do tumor. A supressão da esplenomegalia pode ter os seus efeitos no mecanismo acima. Similarmente ao estudo anterior, os tumores mamários induzidos pelo PHIP foram identificados como tumores ER-a positivos por imunocoloração, embora os nossos resultados apresentem valores maiores. A administração dietética do extrato de soja isoladamente reduziu levemente os tumores representados em mais de 60% das células ER-a positivas. Em contraste, o L. casei Shirota, em combinação com o extrato de soja, reduziu fortemente os tumores apresentados em mais de 50% das células ER-a positivas. As isoflavonas de soja, como a daidzeína, genisteína e o equol, que é metabolizado pelos microrganismos intestinais, são reconhecidas por reduzirem a expressão das células ER-a sobre as MCF-7, células do câncer de mama em humanos que apresentam um crescimento estrogênio dependente. Além disso, a ingestão de probióticos reduz a excreção simultânea das isoflavonas de soja. Os Lactobacillus casei Shirota potencializam a atividade anti-hormonal por meio do estímulo da conversão das isoflavonas de soja em alguns metabólitos ativos, como o equol e/ou a absorção de isoflavona através das alterações do ambiente intestinal.
A classificação de acordo com o Ki-67 LI apresentou a administração dietética do Lactobacillus casei Shirota, em combinação com extrato de soja, e reduziu muito a taxa da população de grau alto comparada à administração do extrato de soja isoladamente. Tanto as células ER-a positivas como as Ki-67 positivas foram reduzidas por meio da terapia antihormonal em um procedimento clínico adjuvante, enquanto que o Ki-67 LI não foi afetado pela ingestão de suplementos contendo isoflavonas de soja na fase II da pesquisa. Essas publicações indicam que a redução da população de grau alto pela combinação do Lactobacillus casei Shirota foi causada pelo aprimoramento da atividade anti-hormonal induzida pelo extrato de soja.
Além disso, a administração dietética do LcS isolado aumentou a população de grau baixo. Assim, o extrato de soja e o L. casei Shirota podem agir sobre a expressão do Ki-67, como também sobre a proliferação das células tumorais de diferentes maneiras. Esses resultados imunohistoquímicos revelaram que a administração de Lactobacillus casei Shirota em combinação com o extrato de soja diminuiu a taxa de células ER-a positivas e Ki-67 positivas mais efetivamente do que com o extrato de soja isoladamente. Essa combinação apresentou efeito semelhante à de supressão da multiplicidade do tumor. Estas descobertas indicam que o Lactobacillus casei Shirota aumenta a eficácia preventiva do extrato de soja e pode explicar parcialmente os mecanismos que delinearam os efeitos combinantes do estudo epidemiológico anteriormente publicado.
A avaliação do MVD nos tumores por meio da imunocoloração do CD34 revelou que tanto o extrato de soja como o LcS inibiram a angiogênese tumoral. Vários estudos relataram a atividade antiangiogênese das isoflavonas de soja na carcinogênese dos tumores, entretanto, o melhor para o nosso conhecimento é primeiramente descrever a inibição da angiogênese por meio dos probióticos. Demonstrou-se que o L. casei Shirota possui uma atividade anti-inflamatória através da diminuição da regulação do fator ?B nuclear (NF-?B). Um dos mecanismos angiogênicos das isoflavonas, considerados no desenvolvimento dos tumores, seria a ação anti-inflamatória via diminuição da regulação do NF-?B e COX-2. Por consequência, um mecanismo anti-inflamatório semelhante pode estar envolvido na supressão da gênese do tumor mamário através dos L. casei Shirota. Concluindo, a administração dietética do L. casei Shirota em combinação com o extrato de soja preveniu mais efetivamente a carcinogênese mamária em camundongos expostos ao PhIP do que cada composto em separado. Assim, o consumo habitual de LcS, em combinação com o extrato de soja, pode ser benéfico na prevenção do câncer de mama.
Detalhes
A incidência de tumor nos grupos com extrato de soja e extrato de soja + Lactobacillus casei Shirota foi menor do que nos grupos controle ao longo do período experimental. A supressão na incidência de tumores no grupo com extrato de soja foi estatisticamente significativa na 14ª semana (P = 0,048) e na 16ª semana (P = 0,049), respectivamente. Além disso, a multiplicidade dos tumores foi bastante reduzida nos grupos com extrato de soja e extrato de soja + Lactobacillus casei Shirota comparada com o grupo controle. Assim, houve indícios de que a administração do extrato de soja retardou o desenvolvimento dos tumores mamários. No exame histológico das glândulas mamárias usando a coloração H&E, a maioria dos tumores foi diagnosticada como adenocarcinoma, com exceção de três casos de fibroadenoma. Células atípicas foram observadas na maioria dos tecidos, entretanto, diferenças numéricas não foram detectadas entre os grupos. A incidência e a multiplicidade dos tumores mamários nos grupos com extrato de soja e extrato de soja + LcS foram menores do que no grupo controle. Em particular, a multiplicidade dos tumores nos grupos com extrato de soja + LcS foi menor do que a metade do valor do grupo controle (P = 0,014). Os volumes dos tumores dos grupos Lactobacillus casei Shirota e extrato de soja + LcS também foram menores do que os do grupo controle.