Auxiliar na prevenção de doenças

Sequenciamento genético do microbioma permite identificar as várias espécies de microrganismos para auxiliar o diagnóstico e tratamento de doenças

Adenilde Bringel

Em 2012, a revista Nature e vários periódicos da Public Library of Science (PLoS) publicaram uma série de relatórios científicos, produzidos por cerca de 200 membros do Consórcio Projeto Microbioma Humano (HMP na sigla em inglês), de quase 80 universidades e instituições científicas. Os relatórios apresentaram os resultados de cinco anos de pesquisas sobre o microbioma humano, que resultou no mapeamento da composição microbiana normal de indivíduos saudáveis. Entre outras novidades, os pesquisadores descobriram que quase todas as pessoas saudáveis carregam rotineiramente microrganismos patogênicos, que coexistem em harmonia com os trilhões de microrganismos benéficos que habitam o corpo humano. Além de abrir inúmeras possibilidades para a ciência, o mapeamento microbiano estabeleceu as bases para acelerar as pesquisas sobre doenças infectocontagiosas e deverá levar, inclusive, à revisão de conceitos sobre como os microrganismos causam doenças. Com base no levantamento, agora também é possível mapear o microbioma para auxiliar em ações de prevenção, diagnóstico e tratamento de distúrbios de saúde.

Para definir o microbioma humano ‘normal’, os pesquisadores utilizaram amostras de 242 voluntários saudáveis ​​norte-americanos (129 homens e 113 mulheres), coletando tecidos de 15 locais do corpo masculino e 18 do feminino: boca, nariz, pele (atrás de cada orelha e cotovelo interno), intestino delgado (fezes) e três regiões vaginais, porque cada área pode ser habitada por microrganismos muito diferentes. A pesquisa revelou que, embora a composição microbiana possa variar de pessoa para pessoa, a capacidade metabólica dessas comunidades pode estar relacionada à saúde e à doença. A partir da compreensão do que é um microbioma considerado ‘normal’, os pesquisadores querem entender como as alterações microbianas estão associadas com as doenças e buscam novas abordagens terapêuticas destinadas a manipular o microbioma para tratar enfermidades.

O corpo humano contém trilhões de microrganismos, que superam em 10 vezes a quantidade de células. Esses seres microscópicos habitam majoritariamente pele, boca, nariz, genitais e intestino, com perfis específicos em cada sítio de acordo com as espécies de bactérias, sua riqueza e diversidade. O ambiente intestinal, que abriga 70% desse universo microbiano, é o mais relevante para determinação de diversos estados de saúde ou doença e, por isso, é o mais frequentemente sequenciado. Embora ainda tenha muito a ser descoberto sobre esse microscópico universo, já é consenso que diversas doenças podem modificar a assinatura microbiana, promovendo uma disbiose em relação a determinados filos, gêneros ou espécies comumente encontrados em indivíduos saudáveis. A disbiose tanto pode ser a causa da doença como o contrário, e há situações em que já se identificou a correlação entre disbiose e doença, mas ainda não é possível afirmar se o desequilíbrio é causa ou consequência da enfermidade.

Um exemplo é a disbiose causada pela escassez ou pelo excesso de uma espécie chamada Akkermansia muciniphila, considerada a bactéria mucolítica degradante mais abundante em um indivíduo saudável, com percentuais normais que variam de 2% a 5%. “Com níveis baixos de Akkermansia, o organismo não produz muco por falta de estímulo. Por outro lado, níveis acima do percentual desejável desta bactéria podem reduzir a camada de muco intestinal e favorecer a agressão ao epitélio, pois o muco é consumido em uma velocidade maior do que o organismo consegue repor”, detalha o médico gastroenterologista Dan Waitzberg, professor associado da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), diretor científico do Bioma4me e diretor presidente do Ganep Nutrição Humana. Com pouco muco, a capacidade de barreira do intestino fica reduzida e se traduz em manifestações clínicas, a exemplo de distúrbios digestivos, que incluem plenitude gástrica, distensão abdominal, acúmulo de gases, diarreia, cólon irritável ou sensação de dor; alergias sazonais; doenças inflamatórias, que podem se manifestar como artrite reumatoide, tireoidite ou psoríase; doenças cutâneas como acne, erupções ou eczema; além de ansiedade, depressão, intolerâncias alimentares e halitose.

“As doenças inflamatórias intestinais foram as primeiras nas quais se desconfiou da influência do microbioma, apesar de sabermos hoje que muitas outras, inclusive as metabólicas, podem estar envolvidas com a disbiose”, enfatiza o professor adjunto do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências da Universidade Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) – campus Rubião Junior/Botucatu, Josias Rodrigues. Quando a disbiose é causa, a análise do microbioma em laboratório pode auxiliar na prevenção de enfermidades. Em muitos casos, como a artrite reumatoide, por exemplo, esse desequilíbrio pode ser identificado antes de surgirem as primeiras queixas clínicas e o microbioma pode ser tratado antes que os sintomas se instalem. Por outro lado, quando a disbiose é consequência da doença, a análise do microbioma pode ser ferramenta acessória importante para um diagnóstico acurado, assim como ajuda no tratamento ao caracterizar de maneira detalhada a situação do paciente e auxiliar na escolha de medicamentos mais eficientes, contribuindo de forma relevante para a personalização da medicina.

Segundo o médico Dan Waitzberg, no caso de disbiose como consequência de uma doença há possibilidade, inclusive, de fazer uma intervenção sobre o microbioma para aproximar o seu perfil da distribuição normal e contribuir para a melhora clínica. “Sabemos que, frequentemente, a doença resulta de desordens bioquímicas condicionadas pela expressão maior ou menor de nossos genes. O microbioma humano contém exponencialmente mais genes do que a quantidade de genes humanos e, por isso, é muito provável que o maior conhecimento do microbioma venha a ser crítico para prevenir e tratar diversas doenças”, afirma. As principais indicações para usar o microbioma como adjuvante ao tratamento ou prevenção são as doenças neurológicas, psiquiátricas, respiratórias, cardiovasculares, gastrointestinais, hepáticas, autoimunes, metabólicas e oncológicas.

Metodologia está disponível no Brasil

Para mapear o microbioma humano de maneira completa e interpretar o perfil microbiano de um indivíduo é necessário fazer um sequenciamento genético da microbiota presente nos cinco sítios, e uma análise desses microrganismos, que é a distribuição de frequência das centenas de espécies de microrganismos que habitam o corpo. O processo é relativamente simples: o paciente envia, para um laboratório especializado, uma pequena amostra de material clínico (se for do intestino, de fezes), que possui DNA de todas as espécies e células em quantidade mais do que suficiente para o processo de sequenciamento genético. No caso dos outros sítios, para coletar uma amostra basta esfregar um cotone­te estéril na região desejada, imergir em solução esterilizada e preservadora de DNA e repetir o mesmo processo. Desta maneira, é possível reconhecer as diversas espécies­ bacterianas presentes na amostra e calcular sua abundância percentual em relação ao total. O DNA é extraído da amostra e o processo de sequenciamento identifica pares de bases nitrogenadas (A,T,C,G) contidos em um gene denominado 16s ribossomal.

“Este gene é característico de bactérias e tem algumas regiões muito variáveis, o que permite comparar o resultado do sequenciamento com uma vasta base taxonômica de dados e, assim, identificar de maneira inequívoca uma bactéria”, explica o médico Dan Waitzberg. ­ O mapeamento pode ser realizado por meio das técnicas de sequenciamento genético 16s rRNA ou shotgun, pelas quais é possível identificar as diversas espécies de microrganismos presentes na amostra, assim como a respectiva abundância relativa. A técnica 16s sequencia apenas uma parte (regiões v3, v4 ou v5) do gene para identificar uma bactéria e a precisão de identificação fica em torno de 95% em nível de gênero e 50% em relação à espécie – por isso tem custo mais baixo –, enquanto a shotgun sequencia todo o genoma e consegue identificar mais de 99% dos gêneros e espécies presentes em uma amostra. A shotgun também identifica vírus e fungos, microrganismos que não são passíveis de identificação pela 16s.

Uma vez mapeado o microbioma, o passo seguinte é a interpretação deste perfil. “A cada mês são publicadas dezenas de novos artigos apresentando interpretações para diversos perfis de microbioma humano, cuja análise poderá desempenhar papel relevante em prevenção, diagnóstico e tratamento de distúrbios da saúde. Os próximos anos serão pródigos em achados relevantes”, argumenta o médico Dan Waitzberg. ­Já existem alguns laboratórios que oferecem regularmente o serviço, como Ubiome, nos Estados Unidos; MapMyGut,­ na Inglaterra; e Bioma4me,­ no Brasil, todos privados, além do Laboratório de Microbioma e Genômica Bacteriana da UNESP de Rubião Junior/Botucatu. A recomendação é fazer sequenciamento do microbioma anualmente, a partir dos 50 ou 60 anos, para detectar se o processo de redução da diversidade microbiana já começou a se manifestar.

PROBIÓTICOS – A dieta também interage com a microbiota e, dependendo da alimentação, vai se estabelecer um tipo de bactéria predominante no intestino. As melhores intervenções por meio da alimentação incluem o uso de probióticos e prebióticos, além de bons hábitos de vida. “A alimentação é um dos principais fatores moduladores da microbiota intestinal e fundamental para a composição do microbioma. Se temos uma dieta rica em fibras e probióticos, por exemplo, haverá aumento de bactérias benéficas para o intestino e a saúde”, afirma a nutricionista Karina Al Assa, especialista em Nutrição Clínica Funcional e mestranda em Ciências pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O sequenciamento microbiano também poderá sugerir qual a suplementação de prebióticos, probióticos e simbióticos é a mais adequada em função do perfil de empobrecimento apresentado.

Muito para ser descoberto pela ciência

Estabelecer o papel do microbioma na saúde e na doença é um grande desafio para a ciência, pois diversas variáveis estão interrelacionadas, entre as quais a definição dos genes humanos que influenciam a composição da microbiota intestinal, genes microbianos que influenciam a expressão dos humanos, quanto o metabolismo de alguns microrganismos intestinais influencia o metabolismo de outros e se a dieta influencia a microbiota e a expressão de genes humanos. “Em suma, os genes humanos, microbianos e a dieta compartilham um conjunto complicado de interdependências. Também é preciso ter em mente que, diferentemente da composição dos genes, que é imutável ao longo da vida, o perfil do microbioma é variável”, explica o médico Dan Waitzberg. Um determinado perfil de microbioma pode estar associado ao desenvolvimento de determinada doença e, assim, modificar-se­­­ antes que se instale. Apesar de já haver muito conhecimento sobre o microbioma, a ciência ainda se esforça para responder quais são os processos e fatores mais importantes na construção de um microbioma saudável; se diferentes trajetórias de montagem do micro­bioma determinam a saúde e a doença, e como; quais são os determinantes mais importantes da estabilidade e resiliência do microbioma; como estabilidade e resiliência de um microbioma associado à saúde podem ser fortalecidas e como este perfil pode ser restaurado.

O professor Josias Rodrigues considera a análise do microbioma um tema muito atraente, mas ainda bastante complexo, porque não adianta identificar um determinado microrganismo sem saber se está vivo ou morto. O docente ressalta que a maioria das bactérias do microbioma ainda é uma ‘caixa preta’ para a ciência, porque não se sabe como se comportam por não ter como reproduzi-las­­­ em laboratório. Até hoje, apenas 40% dessas bactérias foram cultivadas fora do ambiente intestinal. Outro ponto importante é a variabili­dade genética e fenotípica existente dentro de cada espécie, de modo que a identificação do microbioma em nível de espécie pode não refletir essas variações e eventual papel na saúde e doença. “A E. coli, por exemplo, é uma espécie que inclui tanto bactérias que podem matar como outras consideradas probióticas e, portanto, benéficas à saúde. Alguns autores respeitados acreditam, inclusive, que a E. coli seria a responsável pela doença de Crohn. A bactéria é a mais conhecida com esse perfil, mas tem uma infinidade de outras espécies que ainda desconhecemos”, relata.