Ação positiva na cirrose hepática

L. casei Shirota promove a produção de proteína com rápido turnover através da restauração da microbiota intestinal

Koga H, Tamiya Y, Sata M, Mitsuyama K, Division of Gastroenterology, Department of Medicine, Kurume University School of Medicine; Ishibashi M, Orin Hospital, Onojo, Japan; Matsumoto S, Imaoka A, Hara T. Nakan, Ooeda K, Umezaki Y, Yakult Central Institute for Microbiological Research, Tokyo, Japan

Embora o estresse oxidativo gerado pelos hepatócitos durante o metabolismo do álcool e subsequente apoptose seja um fator chave nas injúrias provocadas pelo álcool no fígado, a endotoxina derivada do intestino também desempenha um papel crucial através da ativação anormal das células de Kupffer e monócitos para produzir citocinas pró-inflamatórias hepáticas, incluindo o fator de necrose tumoral (TNF)-α e interleucinas (ILs)-1, 6 e 8. Essa cascata pró-inflamatória causa disfunção nos neutrófilos e ativação das células estreladas hepáticas (CEHs), contribuindo para a fibrogênese e, finalmente, para a cirrose hepática alcoólica (ALC, na sigla em inglês). A translocação bacteriana e o influxo de endotoxina proveniente de um intestino com a permeabilidade da barreira alterada são dois fatores a serem considerados críticos para a patogênese da ALC. Entretanto, a erradicação dos patógenos bacterianos intestinais com antibiótico tem sido mostrada como inibidor efetivo de injúrias provocadas pelo álcool no fígado em modelos animais, levantando a forte possibilidade de que as doenças do fígado podem ser controladas por modulação da microbiota intestinal.

Muitos estudos têm demonstrado recentemente que a administração de probióticos para pacientes com cirrose, mais do que de antibióticos, produziu efeitos clínicos e biológicos favoráveis, incluindo redução significativa na quantidade de bactérias nocivas no intestino e na frequência de complicações associadas à cirrose, como encefalopatia hepática e infecções após transplante de fígado. Alguns estudos nos levam a especular que as interações na comunidade bacteriana estão envolvidas na patogênese da lesão no fígado em pacientes com ALC, entretanto, as limitações técnicas associadas com a cultura bacteriana fecal ex vivo impediram análises detalhadas da diversidade da microbiota intestinal nesses pacientes. O PCR quantitativo em tempo real (qPCR) com primers específicos para vários DNAs bacterianos tem sido utilizado para superar essa limitação e delinear mais precisamente o perfil da microbiota intestinal. Esta técnica emergente permite uma análise molecular precisa e sensível com alto rendimento e identifica bactérias não caracterizadas, mas aparentemente clinicamente importantes.

O Lactobacillus casei Shirota (LcS) é um microrganismo Gram positivo não patogênico comercializado em muitos países como alimento saudável, que modula a microbiota e o sistema imune intestinal. Foi demonstrada previamente a eficiência do LcS em um modelo animal com inflamação intestinal, sugerindo que a atividade anti-inflamatória do LcS exerce um efeito hepatoprotetor. Certamente, o LcS tem demonstrado que regulariza a disfunção dos neutrófilos, um indicador do aumento do risco de infecção e mortalidade em pacientes com ALC, entretanto, ainda não foram demonstrados o efeito direto anti-inflamatório indicado pela composição química do sangue e as alterações da microbiota intestinal validadas por PCR em pacientes com ALC tratados com L. casei Shirota. Os efeitos hepatoprotetores podem ser avaliados pelo monitoramento dos níveis séricos de proteínas hepato-específicas [isto é, suprarregulação da proteína C-reativa hipersensível (h-CRP) e superregulação de transtirretina (pré‑albumina) e transferrina]. Portanto, focamos se tais alterações favoráveis à proteína espelhada estiveram associadas ou não com a melhoria da microbiota intestinal em pacientes com ALC tratados com LcS. Neste estudo randomizado, placebo controlado foram demonstrados, pela primeira vez, uma redução significativa no h-CRP e um aumento na transtirretina, ambos associados com o sugestivo aumento na albumina e na transferrina, em paralelo às melhorias no ambiente bacteriano intestinal desequilibrado dos pacientes com ALC.

O estudo foi realizado entre 14 de outubro de 2005 e 13 de outubro de 2006. Um total de 62 indivíduos com ALC (idade ≥ 20 anos) recém-admitidos no Hospital Orin, um centro de tratamento do alcoolismo ligado à Universidade Kurume (H.K.), foram consecutivamente inscritos no estudo. Os participantes foram considerados com alcoolismo se o consumo de álcool excedia 80g/dia (homens) ou 30g/dia (mulheres) há mais de cinco anos. Pacientes com cirrose de classificação Child-Pugh grau A, mas não grau B ou C, foram qualificados para o estudo: a cirrose foi diagnosticada tanto histologicamente quanto nos pacientes que recusaram biópsia ou nos que foram contraindicados, baseando-se em evidências clínicas, bioquímicas e radiológicas. Pacientes com bilirrubina total elevada (≥ 3mg/dL) foram excluídos do estudo. Todos os soros dos participantes foram negativos para o antígeno de superfície do vírus da hepatite B, anticorpo essencial anti-hepatite B e anticorpo viral anti-hepatite C. Todos os pacientes que consumiam probióticos, prebióticos, antibióticos, medicamentos à base de ácido biliar (ácido ursodesoxicólico) e/ou suplementos nutricionais nos meses anteriores foram excluídos.

Desenho do estudo

Todos os participantes qualificados foram randomicamente separados em dois grupos: Y400 (n=24) e placebo (n=25). A randomização foi realizada pela Universidade Kurume utilizando computador gerador de números aleatórios. Tanto o Y400, contendo 40 bilhões de unidades formadoras de colônia de L. casei Shirota (YIT 9029) por frasco quanto o alimento placebo foram fornecidos duas vezes ao dia (manhã e noite) nas duas primeiras semanas do estudo, que durou quatro semanas. A administração foi iniciada em até três dias a partir da internação do participante no hospital. O volume (80ml), valor calórico (62kcal) e todos os ingredientes (açúcar, leite desnatado e aroma), exceto o LcS (Y400) ou ácido lático (placebo), foram os mesmos para ambos os alimentos, colocados em copos sem rótulo para manter o ‘cego’. Nenhum outro produto lácteo foi disponibilizado durante o período. Amostras de soro foram coletadas semanalmente e armazenadas a -30°C até o uso. Testes convencionais da função hepática foram realizados nas amostras pelo Departamento de Inspeção Clínica da Universidade de Kurume e as proteínas de rápido turnover, como transtirretina (faixa normal 22 – 44mg/ml; ensaio de imunoabsorção enzimática, Life Science, Inc., Missouri City, TX, EUA), transferrina (190 – 340mg/dL; imunonefelometria, SRL, Tóquio, Japão) e ambos h-CRP (<1,0mg/L; kit nefelométrico aprimorado com látex, Siemens Japan KK, Tóquio, Japão) e IL-6 (<4,0 pg/ml; imunoensaio enzimático quimioluminescente, SRL) foram realizados simultaneamente. Amostras fecais foram obtidas nas semanas 0, 2 e 4 e armazenadas a -30°C até o uso. O formulário de consentimento para participar do estudo foi obtido de cada participante conforme os princípios da Declaração de Helsinki e do Guia do Comitê Ético da Universidade de Kurume (registro 2509; Presidente: Michiaki Yakushiji).

As amostras fecais coletadas enviadas ao Instituto Central Yakult foram descongeladas e diluídas com solução salina tamponada com fosfato para subsequente extração de DNA. Amostras padrão de DNA também foram preparadas com 109 células/ml de culturas bacterianas representativas. As amostras teste ou padrão foram homogeneizadas em placas de 96 cavidades com uma solução de reação contendo SYBR Premix Ex Taq, ROX Reference Dye (Takara Bio, Otsu, Japão) e estabelecidos os conjuntos de primers específicos para as bactérias de interesse. Os reagentes de PCR foram distribuídos de maneira automatizada utilizando um multidispenser LY-384 (Life Technologies, Tóquio, Japão). O qPCR em tempo real foi executado com um sistema de detecção de sequência ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) sob condições previamente otimizadas. O limite de detecção de cada ensaio foi de 106 células/g. Dados analíticos de bactérias fecais obtidos previamente de duas pessoas saudáveis (n=46 e n=39) foram utilizados como referência. Os níveis de significância estatística foram avaliados utilizando o teste de Qui-Quadrado, teste t pareado e teste U de Mann-Whitney. O valor de P<0,05 foi considerado significativo estatisticamente.