A ação positiva do LcS em indivíduos saudáveis

Estudo mostra recuperação de Lactobacillus casei Shirota do intestino de indonésios após consumo do leite fermentado, e impacto na microbiota fecal

Muitos estudos reportam os efeitos benéficos dos probióticos na saúde humana. A eficácia do probiótico depende da sua capacidade em sobreviver no trato digestório e proliferar no intestino, e a viabilidade depende da cepa utilizada e de fatores intrínsecos e extrínsecos. A capacidade de Lactobacillus e Bifidobacterium sobreviverem no trato gastrointestinal (TGI) varia consideravelmente entre as espécies, pois as bactérias ingeridas estão expostas a condições adversas quando chegam ao estômago. A sobrevivência depende do tempo necessário para a bactéria atravessar o estômago e a taxa de esvaziamento gástrico é obviamente um fator importante para a sobrevivência do microrganismo. No intestino delgado, especialmente na parte proximal, existem enzimas hidrolíticas e sais biliares conhecidos por terem efeito letal sobre os microrganismos. Assim, a passagem através deste segmento também pode afetar significativamente a sobrevivência das bactérias ingeridas.

Fatores como tipo e composição do alimento consumido, estilo de vida, idade, ambiente e raça têm influência na taxa de esvaziamento gástrico e, portanto, também influenciam a sobrevivência de bactérias probióticas. De acordo com relatos anteriores, o Lactobacillus casei Shirota (LcS) é capaz de sobreviver e colonizar o trato gastrointestinal. A ingestão de leite fermentado contendo LcS pode proporcionar vários benefícios ao hospedeiro, como melhora da microbiota e do ambiente intestinal, frequência de evacuação e qualidade das fezes, diminuindo os sintomas gastrointestinais. Também já foi relatado que a ingestão de leite fermentado contendo LcS pode influenciar o nível de atividade das células NK em pessoas saudáveis, restaurar a atividade das células NK em fumantes habituais e modular a resposta imunológica na rinite alérgica. Entretanto, até agora não havia relatos que provassem que a cepa Lactobacillus casei Shirota também seria capaz de sobreviver no TGI e competir com a microbiota na população da Indonésia. Portanto, este estudo foi realizado para investigar a capacidade do LcS em sobreviver e colonizar o TGI de participantes indonésios saudáveis após o consumo de leite fermentado contendo esta bactéria e o impacto do LcS na população de Enterobacteriaceae nas fezes. Qualidade das fezes, frequência de evacuação e desconforto dos participantes também foram monitorados.

Este estudo envolveu 26 participantes saudáveis (6 homens e 20 mulheres), com idades entre 18 e 23 anos (média de 21 anos). Os critérios de inclusão foram índice de massa corporal normal (IMC de 18,5 a 29,9) e sem histórico de desordem gastrointestinal (constipação, diarreia, dor abdominal ou síndrome do intestino irritável). Os participantes não consumiram medicação antibiótica, antimicótica, antidiarreica ou laxante, nem alimentos probióticos ou prebióticos como parte da dieta diária por 30 dias antes de iniciar o estudo, que foi realizado de acordo com as Boas Práticas Clínicas (BPC) – como definido pela Conferência Internacional de Harmonização (ICH) – e de acordo com o Guia da Agência Nacional para Controle de Alimentos e Medicamentos da Indonésia. O Termo de Consentimento foi obtido de todos os participantes e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonésia. Todos os participantes foram cobertos pelo seguro da Tokio Marine, Jakarta, Indonésia. O produto estudado foi o leite fermentado contendo 6,5×109 de LcS por 65ml preparado pela PT. Yakult Indonesia Persada. O LcS é o Lactobacillus casei Shirota cepa YIT 9029 depositado na coleção de cultura do International Depositary Authority, Agency of Industrial Science and Technology of Japan, sob o número de registro FERM BP-13666. O produto de estudo foi armazenado sob refrigeração (<10°C) até o consumo dos participantes.

Experimento consistiu de período basal, ingestão e acompanhamento

Este foi um estudo experimental, com pré e pós-testes e que consistiu de um período basal de 10 dias, 10 dias de ingestão e 10 dias de acompanhamento. Durante o período basal, os participantes mantiveram sua dieta habitual, com exceção de produtos lácteos fermentados. O período basal foi de wash out para eliminar efeitos de probióticos previamente consumidos. Os participantes preencheram um diário que continha questões sobre o consumo do produto em estudo (somente para o período de ingestão), consumo de outros alimentos, número de evacuações, qualidade das fezes (consistência e cor), medicações utilizadas e sintomas de desconforto como diarreia, constipação, vômito, gases, sensação de doença e outros. As amostras de fezes e os diários foram coletados na manhã do 10º dia (final do período basal e início do período de ingestão). Durante o período de ingestão (início no 10º dia até o 19º), os participantes ingeriram um frasco do produto de estudo por dia, após o almoço, por 10 dias seguidos. Não foi permitido o consumo de outros leites fermentados e foi solicitado o preenchimento de um segundo diário. Após completar o período de ingestão, na manhã do 20º dia, amostras de fezes e os diários foram coletados. No período de acompanhamento, os participantes continuaram com sua dieta normal com a exclusão do consumo de produtos lácteos fermentados e do produto de estudo, e preencheram um terceiro diário. Amostras fecais e os diários foram coletados na manhã do 30º dia. Todas as amostras fecais foram analisadas para detecção de Lactobacillus casei Shirota, Enterobacteriaceae, E. coli, coliformes não E. coli e pH.

Coletadas em casa pelos participantes em tubos estéreis com espátula adaptada no interior da tampa, as amostras de fezes foram imediatamente transportadas para o laboratório em embalagem térmica (<10°C). Os materiais e as instruções para a coleta das amostras fecais foram fornecidos antes do cronograma de coleta e os participantes foram instruídos a evacuar no papel (lado liso para cima), não molhar as fezes com urina ou água e, imediatamente, coletar a amostra com a espátula e tampar bem o tubo. A quantidade de LcS nas fezes no final dos períodos basal, ingestão e acompanhamento foi quantificada por meio do plaqueamento, utilizando um meio de ágar seletivo específico para cepa (FOM-LLV) e confirmado pelo método ELISA. As amostras fecais foram homogeneizadas em PBS com nove volumes do peso e a diluição seriada de cada suspensão fecal foi realizada usando PBS. Cada suspensão fecal diluída foi inoculada em placas com ágar FOM-LLV e espalhada na superfície das placas com alças Conradi. As placas foram incubadas aerobicamente a 37°C por 96 horas. As colônias grandes, brancas e de formato arredondado foram analisadas pelo método ELISA, para identificar se eram ou não LcS.

A contagem dos grupos selecionados de bactérias das amostras fecais no final dos períodos basal, ingestão e acompanhamento foram medidos usando o método de cultura em ágar seletivo. Para a população de Enterobacteriaceae foi utilizado o meio ágar Violet Red Bile Glucose (VRBG), enquanto que a população de Escherichia coli e coliformes não E. coli foi contada usando meio ágar seletivo Brilliance E. coli/Coliform da Oxoid. A coloração e a consistência nos períodos basal, ingestão e acompanhamento foram medidas pelos participantes e registradas no diário. A consistência das fezes foi medida baseada na Escala de Bristol de sete pontos: pequenas bolinhas duras separadas como coquinhos (difícil de passar); formato de linguiça encaroçada, com pequenas bolinhas grudadas; formato de linguiça com rachaduras na superfície; alongada com formato de salsicha ou de cobra, lisa e macia; pedaços macios e separados, com bordas bem definidas (passagem fácil); massa pastosa e fofa, com bordas irregulares; sem pedaços sólidos, totalmente líquido.

A cor das fezes foi mensurada com a escala amarelo (1), marrom amarelado (2), marrom (3) e verde (4). Para a medição do pH foi adicionado aquades às amostras fecais, na proporção de 1:1, e medido por contato direto com o eletrodo do pHmetro (Eutech Instruments pH510 cyberscan). A análise de dados foi realizada utilizando o software SPSS 16.0 que inclui descritivo e homogeneidade no teste de variância. A análise descritiva é executada para descrever as características dos participantes no período basal (dia 10), visita 2 (dia 20) e visita 3 (dia 30). A significância das diferenças na população bacteriana, número de evacuações, qualidade e pH fecal dentro da intervenção (antes, durante e após o consumo) foram determinadas utilizando o teste Friedman. Para a análise post hoc foi aplicado o teste sinalizado de Wilcoxon.

Discussão mostra benefícios do L. casei Shirota

Não houve desistência nem renúncia dos participantes até o fim do estudo, e o número de mulheres foi maior que o de homens na proporção de 76,9% e 23,1%. A etnia foi dominada por javaneses (84,6%), que são o maior grupo étnico na Indonésia. As outras etnias foram chinês, balinês e minang. Todos os participantes tinham IMC normal (21,93 ± 2,18kg/ m2) com peso médio de 57,15 ± 8,62kg/m2, e havia quatro pessoas com medicação concomitante (15,4%). Sem exceção, foram detectados aproximadamente 6,6 ± 0,6 log10 UFC de LcS/g fezes em todas as amostras após 10 dias de consumo. O número de LcS recuperado das fezes de todos os participantes saudáveis – após consumirem diariamente um frasco de leite fermentado com 109 UFC de LcS por 10 dias – demonstrou que uma porcentagem adequada de LcS sobrevive à passagem pelo TGI. Resultados similares foram relatados por Matsumoto et al. (2010) ao descobrirem que o consumo de um frasco por dia de leite fermentado contendo LcS com 4×109 células bacterianas/frasco por quatro semanas resulta na recuperação de LcS vivos em nível de 6,9 ± 1,3 e 7,2 ± 0,8 log10 UFC/g fezes em indivíduos saudáveis, com fezes macias após duas e quatro semanas, respectivamente.

Oozer et al. (2006) descobriram que a bactéria probiótica Lactobacillus casei DN-114 001 tem a capacidade de sobreviver durante o trânsito através do intestino humano. A taxa de sobrevivência do L. casei DN-114 001 nas fezes humanas foi menor do que no íleo. Maiores níveis de recuperação de LcS nas fezes foram relatados por outros pesquisadores. O LcS foi recuperado das fezes de participantes saudáveis que consumiram leite fermentado, com ingestão diária de 10,1 log10 de células vivas de LcS por quatro dias, com recuperação média de 6,79 ± 0,56 log10 células/g fezes. O consumo de 100ml de leite fermentado com 109 UFC de LcS/ml três vezes ao dia, por quatro semanas, resultou no aumento do número de LcS em nível de 107 UFC/g fezes em homens saudáveis. Tuohy et al. (2006) relataram que sete dias após a ingestão de dois frascos de 65ml de leite fermentado com 8,6 ± 0,1 log10 LcS UFC/ml, por 21 dias, a média de LcS por grama de fezes de nove participantes saudáveis foi de 7,1 ± 0,4 log10 UFC, utilizando a técnica de hibridização  fluorescente in situ (FISH). A quantidade desta cepa foi mantida neste nível durante o período de ingestão até o dia 21. O número de LcS nas fezes atingiu níveis de 8,1 ± 0,9 log10 UFC/g fezes quando 14 homens saudáveis ingeriram o leite fermentado comercialmente disponível (Yakult 400, volume de 80ml), com 1011 UFC de LcS, uma vez ao dia, por sete dias. Parece que a dose de leite fermentado consumido influenciou no número de LcS recuperado das fezes. Quanto maior a quantidade de LcS consumido, maior a quantidade de LcS nas fezes. Outra possibilidade de diferença no maior número de LcS recuperado nas fezes é devido ao método de quantificação do microrganismo. Fujimoto et al. (2008) avaliaram o número de LcS em fezes humanas utilizando um kit primer específico para LcS (p-LcS) derivado de análise de DNA polimórfico amplificado randomizado (RAPD). O número de LcS detectado nas fezes pelo qPCR foi consideravelmente maior do que o encontrado em métodos de cultura, já que este método pode contabilizar tanto células mortas quanto vivas.

No fim do período de acompanhamento, o número de LcS nas fezes diminuiu significativamente em todos os participantes. Oito amostras mostraram que o LcS não foi detectado no final deste período, indicando que a cepa não coloniza o intestino permanentemente. Entretanto, o LcS foi recuperado em 18 dos 26 participantes 10 dias após o término do consumo de leite fermentado, variando de 3,2 a 6,1 log10 UFC/g fezes, com média de 4,3 ± 0,8 log10 UFC/g fezes, indicando alguma persistência. Spanhaak et al. (1998) relataram que, após cessar a administração de leite fermentado, o número de LcS voltou aos níveis de pré-tratamento. Depois que os participantes pararam a ingestão por sete dias, as contagens fecais de LcS utilizando método de cultura diminuíram diariamente. O LcS foi detectado nas amostras de fezes em todos os participantes no dia 9 a 6,1 ± 1,3 log10 UFC/g; em 12 dos 14 participantes no dia 11 a 4,7 ± 0,9 log10 LcS/g; e em cinco dos 14 participantes no dia 14 a 3,1 ± 0,5 log10 LcS/g. Estes dados sugerem que o LcS pode viver e proliferar no intestino por mais de sete dias após a ingestão. Em muitos participantes, o LcS ainda foi detectado uma semana após a finalização do consumo do leite fermentado com o probiótico, indicando que o LcS pode se multiplicar no trato intestinal humano por algum tempo. Neste estudo, o LcS pôde ser detectado em 18 participantes (69%) por 10 dias após o término do consumo do leite fermentado. Entretanto, os fatores que controlam a capacidade de colonização do LcS nos diferentes indivíduos ainda são desconhecidos.

As contagens médias de Enterobacteriaceae, E. coli e coliformes não E. coli no período de acompanhamento foram levemente reduzidos se comparados com o período basal. Outros pesquisadores detectaram que o consumo deste leite fermentado teve pouco ou nenhum efeito no número destas bactérias. O nível de Enterobacteriaceae nas fezes de participantes em estado de saúde subótimo no Japão não foi alterado após a ingestão de leite fermentado com LcS por duas semanas. Spanhaak et al. (1998) relataram que o número de enterobactérias fecais em participantes saudáveis após a ingestão de leite fermentado com LcS não foi significativamente diferente daquele antes da intervenção. O consumo de leite fermentado contendo LcS por duas semanas não teve efeito no número de Escherichia coli nas fezes de participantes saudáveis do Reino Unido. Guerin-Danan et al. (1998) também relataram que o total de anaeróbios, bifidobactérias, bacteroides e enterobactérias nas fezes de crianças saudáveis não foi significativamente afetado pelo consumo de leite fermentado com culturas de iogurte e Lactobacillus casei.

Pode ser que pessoas saudáveis, com uma microbiota intestinal normal e estável, não tenham uma mudança da microbiota fecal de grande magnitude. Entretanto, neste estudo, quase metade dos participantes mostrou uma redução no número de Enterobacteriaceae, E. coli e coliformes não E. coli após o consumo do leite fermentado contendo LcS por 10 dias. A redução na quantidade de bactérias variou de 0,1 a 1,8 ciclos log, de 0,2 a 2,4 ciclos log e 0,1 a 2,0 ciclos log para Enterobacteriaceae, E. coli e coliformes não E. coli, respectivamente. Isso significa que o consumo de leite fermentado contendo LcS pode reduzir a população de Enterobacteriaceae nas fezes de alguns indivíduos. A composição individual das espécies de bactérias láticas e bifidobactérias dos participantes pode fornecer alguns impactos na composição e população de outros organismos nas fezes.

O número de evacuações por 10 dias foi relativamente sem mudanças ao longo do estudo, variando de 10,5 ± 0,5 a 12,0 ± 2,1. Durante o período basal um participante teve diarreia, entretanto, a maioria teve evacuações todos os dias, uma vez ao dia. Similarmente, o número de dias com evacuações também permaneceu o mesmo. A frequência de evacuações indicou que os participantes tinham uma tendência à evacuação regular. Assim, todos foram considerados indivíduos saudáveis com frequência de evacuação normal. Isso também foi indicado pela consistência e a cor das fezes de todos os participantes antes do tratamento, com pontuação de 4,2 e 2,3, respectivamente. Como a frequência de evacuações, a qualidade das fezes e o pH basal permaneceram dentro da faixa normal, é razoável observar nenhuma diferença significativa entre os períodos basal, ingestão e acompanhamento.

Conclusão

O estudo sugere que o consumo de leite fermentado contendo LcS por pessoas saudáveis não altera significativamente a frequência de evacuação e a qualidade das fezes. Matsumoto et al. (2006) relataram que não houve efeito significativo no número de evacuações ou no número de dias com evacuações dos participantes com uma tendência mais fraca à constipação (média do número de evacuações antes do consumo 4,5 vezes/semana, n=19) após o consumo do leite fermentado. Entretanto, o consumo de leite fermentado aumentou significativamente o número de evacuações de participantes com forte tendência à constipação. Matsumoto et al. (2010) constataram uma redução significativa na frequência de evacuação e melhora na qualidade fecal (endurecido) em indivíduos saudáveis com fezes macias após quatro semanas de ingestão de leite fermentado com LcS 4,0×109 células bacterianas/frasco. Também houve melhora na frequência de movimentos intestinais e consistência das fezes em pessoas que sofrem com constipação após o consumo regular de LcS. A ocorrência de fezes duras e irregulares no grupo de tratamento foi menor na segunda semana em relação ao início. Esses resultados sugerem que o leite fermentado contendo LcS tem um efeito condicionante no intestino por melhorar a frequência de evacuação e a qualidade das fezes em indivíduos que sofrem com constipação e em indivíduos saudáveis com fezes moles.

O pH foi relativamente estável ao longo do estudo, variando de 6,2 a 6,5. Guerin-Danan et al. (1998) relataram que o valor de pH basal de amostras fecais em crianças saudáveis foi de 6,2 ± 0,8 e, relativamente, não mudou durante a ingestão do leite fermentado com cultura de iogurte e Lactobacillus casei e depois de o consumo ser descontinuado. A redução nos valores de pH fecal de participantes com saúde subótima após uma e duas semanas de ingestão de leite fermentado simbiótico contendo LcS e galactooligossacarídeos foi relatado por Shioiri et al. (2006). A redução no pH no intestino grosso é por causa dos ácidos orgânicos produzidos pelas bactérias (ácido butírico, ácido propiônico e ácido lático) que estimulam a motilidade no cólon. Assim, a mudança no pH fecal é influenciada pelo número e pela atividade dos microrganismos no cólon que produzem ácido, assim como o ácido lático, e outros que produzem amônia/fenol, assim como Enterobacteriaceae, Clostridium e Staphylococcus.

Este estudo demonstrou claramente que o Lactobacillus casei Shirota foi capaz de sobreviver e colonizar o trato gastrointestinal de indonésios saudáveis, e foi encontrado nas fezes de 69% dos participantes após 10 dias de a ingestão do leite fermentado ser descontinuada. Os resultados não somente mostram a recuperação de LcS em todos os participantes, como também foi observada uma redução no número de Enterobacteriaceae, E. coli e coliformes não E.coli nas fezes, após o consumo de LcS por 10 dias, em quase metade dos participantes. Esses resultados estabelecem que o número de evacuações, a qualidade e o pH das fezes dos indonésios saudáveis continuaram inalterados durante o estudo. O artigo foi publicado no International Journal of Probiotics and Prebiotics 2015, 10(2/3): 77-84.